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腸道病毒核酸檢測試劑注冊技術審查指導原則

腸道病毒核酸檢測試劑注冊技術審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對腸道病毒核酸檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導原則是針對腸道病毒核酸檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規強制執行，如有能夠滿足法規要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、范圍

（一）腸道病毒簡介

腸道病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，能引起人類致病的腸道病毒有多種，包括人腸道病毒A、B、C、D組，有100多個血清型。人類腸道病毒主要包括：脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒A組（Coxsackievirus A，CA）、柯薩奇病毒B組（Coxsackievirus B，CB）、人腸道致細胞病變孤兒病毒（簡稱埃可病毒）（Echovirus ECHO）、新腸道病毒等。新腸道病毒為1969年后陸續分離到的，例如新型腸道病毒71型（EV71）等。近年來，鼻病毒（Rhinovirus）被劃入腸道病毒屬，鼻病毒包括A、B、C組，已經先后分離得到140多個血清型。

腸道病毒為球形，直徑28～30nm，核衣殼二十面體立體對稱，無包膜。病毒衣殼由60個相同的殼粒組成，排列為12個五聚體，每個殼粒由VP1、VP2、VP3和VP4四種蛋白組成。

腸道病毒基因組為單股正鏈RNA，全長約為7.2～8.4kb，基因組分為三部分，兩端為保守的非編碼區，在腸道病毒中同源性非常顯著，其中5’端非編碼區常作為腸道病毒通用檢測試劑檢測的靶基因。中間為連續開放讀碼框，包含結構蛋白編碼區和非結構蛋白編碼區，結構蛋白編碼區依次編碼VP4、VP2、VP3和VP1共４個衣殼蛋白。衣殼蛋白不僅含有抗原決定位點，而且還有決定病毒組織嗜性的受體識別位點，介導病毒與細胞的吸附和進入。非結構蛋白編碼區主要負責編碼與病毒基因組復制以及病毒顆粒包裝等有關的蛋白及酶，它們在RNA復制、細胞器修飾，細胞裂解及形態形成中發揮各自不同的功能。

（二）腸道病毒致病性

腸道病毒在腸道中增殖，但通常不引起腸道疾病。90%以上腸道病毒感染為隱性感染，或僅出現輕微的上呼吸道感染或流感樣癥狀。不同腸道病毒可以引起相同的臨床癥狀，同一種病毒可引起幾種不同的臨床疾病。

腸道病毒的傳染源為患者和無癥狀的病毒攜帶者。傳播途徑主要是糞-口途徑，也可通過呼吸道傳播，夏秋季是一年之中的主要流行期。腸道病毒以上呼吸道、咽喉和腸道為侵入門戶，先在局部黏膜和咽、扁桃體等淋巴組織和腸道集合淋巴結中初步增殖，然后釋放入血，形成第一次病毒血癥。擴散至帶有受體的靶組織，再次增殖后，引起第二次病毒血癥和臨床癥狀。脊髓灰質炎病毒識別的受體為免疫球蛋白超家族的細胞黏附分子，只有很少的組織表達這種受體，如脊髓前角質細胞、被根神經節細胞、運動神經元、骨骼肌細胞和淋巴細胞等，柯薩奇病毒和埃可病毒識別的受體在組織和細胞中分布廣泛，包括中樞神經系統、心、肺、胰、黏膜、皮膚和其他系統等，因而引起的疾病譜復雜，大多數腸道病毒為殺細胞病毒、直接對靶細胞產生裂解性感染。各年齡段人群均可感染腸道病毒。

腸道病毒所致的主要疾病有：

1.手足口病：由腸道病毒感染而引起，以發熱，咽喉痛，全身不適，手、足、口腔等部位皮疹或皰疹為主要特征的常見傳染病，大多數手足口病患者癥狀輕微，并且具有自限性，但有相當一部分患者有致死性心肺功能疾病和神經系統并發癥，個別重癥患者病情進展迅速，甚至可導致死亡。我國手足口病疫情尤為嚴峻，其已成為嚴重影響我國居民生命和健康的公共衛生問題。

手足口病致病病原體傳染源為患者或隱性感染者，主要的傳播途徑為糞-口傳播，也可經接觸患者的皰疹液傳播，接觸病人和攜帶者的糞便、唾液和皰疹液污染的日常生活用品均可傳播此病原體，近年來的報道顯示，該病原體也可垂直傳播，導致新生兒重癥感染。人對腸道病毒普遍易感，不同年齡組均可感染發病，以5歲以下兒童為主，尤以3歲以下兒童發病率最高，該病流行無明顯的地區性，全年均可發生，一般5—7月為發病高峰。該病的潛伏期一般為2—10天，平均潛伏期為3—5天，感染者發病前的數天即可從其咽拭子樣本和糞便樣本中檢出病毒，病程為7天左右，咽部排毒可持續在發病后1—2周，而糞便排毒可持續至發病后3—5周。

引起手足口病的腸道病毒包括柯薩奇病毒A組的2、4、5、6、7、9、10、16型等，B組的1、2、3、4、5型等，腸道病毒71型及埃可病毒等，其中以EV71和CA16型較為常見。

2.無菌性腦膜炎：腸道病毒感染引起的一種疾病，常表現為短暫發熱、頭痛等，偶爾有肌肉酸痛，或伴有皮疹，重者出現頸項強直、嗜睡、昏迷、意識障礙、腦膜刺激征等癥狀。目前發現腸道病毒中有60多個血清型能引起無菌性腦膜炎，包括脊髓灰質炎病毒所有型別、柯薩奇病毒A組中的大多數型別、柯薩奇病毒B組的1—6型、埃可病毒大多數型別和腸道病毒71型等。

3.脊髓灰質炎：是由脊髓灰質炎病毒感染而引起的疾病，其中85%由Ⅰ型脊髓灰質炎病毒引起，在我國曾有由Ⅱ、Ⅲ型病毒感染而發病的病例。病毒侵犯脊髓前角運動神經細胞，導致弛緩性肢體麻痹，多見于兒童，故亦稱小兒麻痹癥。

4.皰疹性咽峽炎：主要由柯薩奇病毒A組某些血清型引起，典型的癥狀是在軟腭、懸雍垂周圍出現水泡性潰瘍損傷。

5.流行性胸痛：常由柯薩奇病毒B組引起，癥狀為突發性發熱和單側胸痛。

6.心肌炎和心包炎：主要由柯薩奇病毒B組引起。在嬰兒室可引起暴發性流行，死亡率高。散發流行于成人和兒童。

7.眼病：由柯薩奇病毒A組24v型引起急性結膜炎和EV-D-70型引起的急性出血性結膜炎。

此外，腸道病毒感染可能還與病毒感染后疲勞綜合征、糖尿病相關。

（三）本指導原則適用范圍

1.本指導原則適用于利用熒光探針聚合酶鏈式反應（Real-time PCR）或其他類分子生物學方法，以特定的腸道病毒基因序列為檢測目標，對來源于人體樣本中的腸道病毒核酸進行體外定性檢測，臨床用于輔助診斷手足口病等腸道病毒感染相關性疾病。涉及其他臨床用途的腸道病毒核酸檢測試劑可參考本指導原則。手足口病致病病原體中未包含鼻病毒，因此，鼻病毒不在本指南的討論范圍內。

2.臨床用于檢測手足口病致病病原體的檢測試劑，適用樣本類型應為鼻咽拭子、咽拭子、糞便/肛拭子、皰疹液、腦脊液（僅限出現神經系統癥狀的病例）、血液等。

3.本指導原則適用于腸道病毒通用核酸檢測試劑、單一病毒種檢測試劑及單一病毒血清型檢測試劑。通用檢測試劑所檢病毒型別應至少包括柯薩奇病毒A組的2、4、5、6、7、9、10、12、16型等，B組的1、2、3、4、5型等，腸道病毒71型及埃可病毒等；針對柯薩奇病毒核酸檢測試劑所檢病毒型別應至少包括上述A組與B組中的血清型；針對柯薩奇A組或B組核酸檢測試劑所檢病毒型別應至少包括上述該組所列血清型。針對埃可病毒核酸檢測試劑所檢病毒型別應至少涵蓋埃可病毒3、6、11、14、16、19、25、30等血清型。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、有關產品主要研究結果的總結和評價以及其他等內容，其中，與預期用途相關的臨床適應癥應重點描述申報產品所檢測的腸道病毒型別與臨床適應癥的相關性及相關腸道病毒在我國的流行特征；產品描述應明確申報產品所有可檢出的腸道病毒型別、尚未驗證的腸道病毒型別；同類產品在國內外批準上市的情況，應著重從所檢病毒型別、不同型別檢測的最低檢測限及不同型別間的交叉反應等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。綜述資料的撰寫應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）和《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監督管理總局公告2014年第44號）的相關要求。

（二）主要原材料研究資料

此類產品的主要原材料包括引物、探針、DNA聚合酶、dNTP、逆轉錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶（如適用）、核酸分離/純化組分（如有）、試劑盒質控品及企業參考品等。應提供主要原材料的選擇與來源、制備及質量標準等的研究資料、質控品的確認試驗資料；生產企業還應提供企業參考品的原材料選擇、來源、質量指標、參考品的制備及陰陽性的確認過程等。

1.引物和探針：包括申報產品檢測靶序列的引物和探針以及內對照的引物和探針。應詳述引物和探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。針對檢測靶序列的引物和探針，建議設計兩套或多套引物、探針以供篩選，針對所有預期適用的腸道病毒型別進行檢出準確性和特異性（如交叉反應）的評價，可采用擴增靶序列與所有型別腸道病毒基因組比對研究的方法，最終確認最佳組合，并提交篩選的研究數據。引物、探針的質量標準應至少包括序列準確性、純度檢查、濃度檢查及功能性實驗等。

2.酶：需要的酶主要包括逆轉錄酶、DNA聚合酶，其質量標準如下：

2.1逆轉錄酶應包括核酸逆轉錄活性、無核酸內切酶活性等。

2.2 DNA聚合酶應包括DNA聚合酶活性、無核酸內切酶活性、熱啟動能力、熱穩定性等。

2.3如申報產品中包含尿嘧啶DNA糖基化酶，應對其酶活性及熱穩定性等質量控制標準進行規定。

3.dNTP：質量標準應至少包括純度檢查及功能性實驗等。

4.核酸分離/純化組分（如有）的原理介紹、主要組成、主要原材料的質量控制標準及相關驗證資料。

5.試劑盒質控品

試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒質控品來實現，針對陽性質控品和陰性質控品申請人應明確質控品的來源、質量標準、質控品陰陽性的確認方法及相關驗證資料。申報產品的質控體系應考慮以下幾個方面：

5.1陽性質控品中應含有天然的或人工合成的包含試劑盒所檢測靶序列的RNA，至少應包含臨床較常見的血清型。質控品應參與樣本處理和檢測的全過程，如核酸的平行提取等步驟。企業應對質控品的檢測結果（如Ct值）做出明確的范圍要求。

5.2陰性質控品應不含試劑盒所檢測靶序列的RNA，質控品應參與樣本處理和檢測的全過程，如核酸的平行提取等步驟，以對可能存在的交叉污染產生的假陽性結果進行質量控制。

5.3內對照（內標）可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，申請人應對內對照（內標）的引物、探針設計和模板濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。對內對照的檢測結果（如Ct值）亦應做出明確的范圍要求。

6.企業參考品：應詳細說明有關企業參考品的原料選擇、制備、陰陽性確認等試驗。

企業參考品的核酸性質應與產品預期檢測的靶物質一致。鑒于腸道病毒為RNA病毒，企業參考品可采用滅活病毒、含有腸道病毒基因組的裝甲病毒（或假病毒）、人工克隆或合成的腸道病毒基因組RNA。具體要求如下：

6.1陽性參考品和陰性參考品

陽性參考品應包含本指南范圍中規定申報產品至少應檢出的腸道病毒血清型，例如，腸道病毒通用型檢測試劑陽性參考品應至少包含柯薩奇病毒A組的2、4、5、6、7、9、10、12、16型等，B組的1、2、3、4、5型等，腸道病毒71型及埃可病毒等，其他單一病毒種及單一病毒血清型檢測試劑陽性參考品應包含該類產品至少應檢出的血清型。陰性參考品應考慮檢測特異性的評價，應納入不在試劑盒檢測范圍內的其他腸道病毒血清型樣品（如有）和其他病原體樣品。

6.2檢測限參考品

申請人應明確檢測限參考品中病毒核酸濃度的確定方法，明確檢測限參考品中病毒核酸濃度的確定依據，檢測限參考品中腸道病毒核酸濃度應為申報產品檢測限濃度或略高于檢測限濃度，檢測限參考品應包含申報產品至少應檢出的腸道病毒血清型。

6.3精密度參考品

可不包含所有涉及的腸道病毒血清型，但應選擇多個臨床較常見的型別，針對所選型別應分別至少設置一個弱陽性水平。

若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定，并提交生產工藝驗證報告；如主要原材料購自其他供應商，則需針對供應商的選擇提供評價數據，并提供供應商出具的質量標準、出廠檢定報告以及申請人對該原材料進行的質量檢驗資料。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

1.介紹產品主要生產工藝，可以圖表方式表示，并說明主要生產工藝的確定依據。

2.反應原理介紹。

3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設置，提供相關的研究資料。

4.確定最佳反應體系的研究資料，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應各階段溫度、時間、循環數等。

5.不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

6.如申報產品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行工藝優化的研究資料。

（四）分析性能評估資料

申請人應提交產品研制階段對試劑盒進行的所有性能評價的研究資料，對于每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、試驗方法、可接受標準、試驗數據、統計方法等詳細資料。有關分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點、適用儀器、試劑規格、批號、臨床樣本來源等。

針對不同的樣本類型，申請人應分別完成性能評估，包括陰陽性符合率、最低檢測限、精密度、分析特異性等。

分析性能評價的試驗方法可以參考國際或國內有關體外診斷試劑性能評估的指導原則進行。對于此類產品，性能評估中所用樣品（除非特別說明）可參考上述企業參考品的制備要求。各項性能評價應符合以下要求。

1.核酸分離/純化性能

在進行靶核酸檢測前，應有適當的核酸分離/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸分離/純化的組分，企業都應結合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸分離/純化試劑的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，提供詳細的驗證資料。

2.申請人應明確申報產品所能檢出所有腸道病毒血清型及不能檢出的血清型。建議申請人采用申報產品對目前已知所有腸道病毒血清型樣本進行檢測，以驗證申報產品所檢血清型范圍，用于驗證的樣本可以為臨床收集樣本、病毒基因組或人工構建假病毒。

3.陽性/陰性參考品符合率

陽性參考品的檢測旨在驗證試劑盒檢測范圍內的各腸道病毒血清型均可以在適當的濃度被檢測到，陽性參考品檢測結果應為陽性。陰性參考品旨在評價試劑特異性，陰性參考品檢測結果應為陰性。

4.最低檢測限

申報產品最低檢測限的性能評估資料應包含最低檢測限的確定及驗證過程。

4.1應針對申報產品所能檢出的CA16、CA6、EV71等常見腸道病毒血清型分別進行確定，建議采用培養后病毒原液進行梯度稀釋，配制系列稀釋的樣品進行最低檢測限的評價，系列稀釋度應能夠覆蓋大部分檢出概率區間（0～100%），可通過概率計算或其他適當方法進行測算選取適當檢出率水平的濃度作為最低檢測限確定的標準，如95%（n≥20）的陽性檢出率水平。病毒原液濃度測定建議采用空斑試驗，濃度水平采用空斑形成單位（PFU）為計量單位。

4.2應選擇申報產品最低檢測限或接近最低檢測限的病毒水平對申報產品最低檢測限進行驗證，驗證最低檢測限的樣本應至少包含申報產品所能檢出的CA16、CA6、EV71等常見腸道病毒血清型，應至少選擇多個病毒株進行驗證。企業應能夠提供用于最低檢測限驗證的各個病毒株的來源、型別及濃度水平（PFU）確認試驗等信息。

4.3申請人應明確申報產品最低可檢出的腸道病毒基因拷貝數水平，同時提供確定過程及相關實驗數據，本項研究應針對不同血清型分別確認，所用樣本血清型應包括申報產品最低檢測限參考品設置的血清型。

4.4申報產品檢測企業最低檢測限參考品，檢測結果應滿足相應要求。

5.分析特異性

5.1交叉反應

申請人應針對可能出現在檢測樣本中的病原體進行交叉反應驗證，用于交叉反應驗證的樣品，除腸道病毒外，其他病原體應盡量采用滅活病原體培養物或臨床樣本。建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證，申請人應詳細說明交叉反應樣本來源、病原體鑒定和滴度確定的方法和結果。病原體種類主要考慮以下幾方面：試劑盒檢測范圍以外的其他腸道病毒血清型、樣本中可能出現的其他病原體。建議對以下病原體進行交叉反應驗證：諾如病毒、單純皰疹病毒1/2型、腸道腺病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、輪狀病毒、甲型肝炎病毒、星狀病毒、EB病毒、風疹病毒、麻疹病毒、甲型流感病毒、副流感病毒、乙型流感病毒、巨細胞病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、戊肝病毒、B族鏈球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀菌、弧菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、草綠色鏈球菌、奈瑟菌屬、黏液羅氏菌、變形桿菌等。

5.2干擾試驗

應根據所采集樣本類型，針對可能存在的干擾情況進行驗證。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價，并針對有代表性的腸道病毒血清型，至少在病毒臨界陽性水平進行干擾試驗驗證。干擾物質的選取應至少包括：血紅蛋白、黃疸（僅限血液樣本）、脂血（僅限血液樣本）、白細胞、粘蛋白、常見病毒治療藥物、抗生素、微生態制劑、糞便中未消化的食物纖維等。

6.精密度

企業應對申報產品精密度指標，如標準差或變異系數等的評價標準做出合理要求。因模擬樣本并不能體現臨床樣本可能帶來的所有變異因素，因此精密度評價中所用樣本應至少包含精密度參考品及若干臨床樣本，且精密度評價試驗應包含核酸分離/純化步驟。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求：

6.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應對分析儀、操作者、試驗地點、檢測批次等要素進行相關的驗證。

6.2設定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。

6.3用于精密度評價的臨床樣本均應至少包含3個水平：陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強）陽性樣品，并根據產品特性設定適當的精密度要求，臨床樣本精密度評價中的每一次檢測均應從核酸提取開始。

（五）陽性判斷值確定資料

對于此類試劑，陽性判斷值即為能夠獲得理想的臨床靈敏度和臨床特異性的臨界值（Cutoff），對于熒光探針PCR方法即為Ct值的確定資料。建議采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進行相關研究。申請人可選取適當的臨床樣本進行試驗以確定陽性判斷值。

（六）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實時穩定性（有效期）、開瓶穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，企業也應對樣本穩定性進行研究，主要包括冷藏和冷凍兩種條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內，每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩定性。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

對于樣本提取后不能立即進行檢測的，應明確核酸儲存條件、儲存時間等，同時應提供相應的核酸穩定性研究資料。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）臨床試驗

臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應符合相關法規及《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求。

1.研究方法

對于已有同類產品上市的試劑的臨床研究，選擇境內已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為參比試劑，采用擬申報產品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產品等效或優于已上市產品。另外，申請人還應選擇不少于30例核酸檢測陽性的新鮮采集樣本進行考核試劑與腸道病毒感染檢測的“金標準”方法—病毒分離培養鑒定方法或其他證明腸道病毒感染的方法進行比較研究。如醫院無病毒培養條件，可由該醫院委托其他具有相應條件的機構進行。

對于無法選擇參比試劑的新型腸道病毒核酸檢測試劑，其臨床研究應選擇病毒分離培養鑒定和/或病毒核酸序列測定方法作為參比方法。用于核酸序列測定的引物序列應不同于考核試劑中用于檢測目的基因的引物序列。

臨床試驗中如涉及核酸序列測定方法，則建議對擴增子進行雙向測序。應在臨床研究報告中對選用的測序方法做詳細介紹，并提供以下關于測序試驗的詳細信息及資料：

1.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。

1.2測序方法所用引物相關信息，如基因區段選擇、分子量、純度、功能性試驗等資料。

1.3對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與擬申報產品的相關性能進行適當比對分析。

1.4測序方法應建立合理的陽性質控品和陰性質控品對臨床樣本的檢測結果進行質量控制。

1.5提交有代表性的樣本測序圖譜及結果分析資料。

2.臨床試驗病例數

申報產品臨床試驗總病例數應不低于500例。入組樣本的血清型應滿足如下要求，腸道病毒通用型檢測試劑陽性樣本應至少包含柯薩奇病毒A組的2、4、5、6、10、12、16型等，B組的1、2、3、4、5型等，腸道病毒71型及埃可病毒等，其他單一病毒種及單一病毒血清型檢測試劑陽性樣本應包含該類產品至少應檢出的血清型；上述血清型中常見血清型應包括該型別中不同的基因型，常見血清型陽性病例數單獨統計應滿足統計學要求。單一病毒血清型檢測試劑，臨床試驗中其檢測的血清型應包括該型別中不同的基因型，陽性病例數應滿足統計學要求。

另外，對于已被批準上市的腸道病毒核酸（通用型）檢測試劑，如果在其注冊證有效期內出現了新型腸道病毒的暴發流行，如有需要，生產企業應迅速針對新型腸道病毒開展臨床比對研究，可以采用病毒檢測的“金標準”方法或當時衛生行政部門認可的針對該新型腸道病毒血清型的診斷標準作為參比方法進行臨床比對研究，分別對采集自新型腸道病毒感染（陽性病例不少于30例）、其他常見的腸道病毒及非腸道病毒感染但具有相應癥狀的患者的新鮮樣本進行比對實驗研究，總例數不少于200例，如臨床試驗研究結果可以證明其對新型腸道病毒的檢測能力，申請人應考慮產品預期用途發生的改變，同時提出變更申請，并按相關法規要求提交分析性能評估和臨床試驗研究等資料。

3.臨床研究單位的選擇

應選擇不少于3家（含3家）臨床試驗機構，按照相關法規、指導原則的要求開展臨床試驗。臨床試驗機構的選擇應盡量考慮擬申報產品的特點和預期用途，綜合流行病學背景，受試者的選擇具有一定的地域代表性。且臨床試驗機構應具有分子生物學方法檢測的優勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節，熟悉評價方案。

4.病例選擇及樣本類型

臨床試驗應選擇具有相應腸道病毒感染癥狀/體征或有密切接觸史的人群作為研究對象。申請人在建立病例納入標準時，應考慮到試劑所適用的各年齡段人群的差異。臨床試驗入組病例應與產品預期用途中適用人群一致。

臨床試驗中所涉及的樣本類型應為實際臨床檢測中常用的樣本類型。如申報產品所適用的樣本類型同時包含鼻咽拭子、咽拭子、糞便/肛拭子、皰疹液、腦脊液或血液等多個樣本類型，應針對不同樣本類型分別進行臨床試驗。

5.倫理學要求

臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學準則，必須獲得臨床試驗機構倫理委員會的同意。研究者應考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結果對受試者的風險性，應提交倫理委員會的審查意見。

6.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床研究機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑及所用機型應一致，以便進行合理的統計學分析。另外，考核試劑的樣本類型不應超越參比試劑對樣本類型的檢測要求，如果選擇了參比試劑適用樣本類型以外的樣本，則應選擇病毒分離培養鑒定或其他合理方法對額外的樣本類型進行驗證。

7.統計學分析

對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，如檢測結果一致性分析、陰性/陽性符合率等。對于本類產品對比實驗的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性，統計分析應可以證明兩種方法的檢測結果無明顯統計學差異。在臨床研究方案中應明確統計檢驗假設，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標準。

在數據收集過程中，對于兩種試劑檢測結果不一致的樣本，應采用“金標準”方法或臨床上普遍認為質量較好的第三種同類試劑進行復核，同時結合患者的臨床病情對差異原因及可能結果進行分析。

8.質量控制

臨床試驗開始前，應進行臨床試驗的預試驗，以熟悉并掌握相關試驗方法的操作、儀器、技術性能等，最大限度控制試驗誤差。整個試驗過程都應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

9.臨床試驗總結報告撰寫

根據《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述。

9.1臨床試驗總體設計及方案描述

9.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

9.1.2病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數及標準、樣本編盲和揭盲的操作流程等。

9.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

9.1.4統計學方法、統計軟件、評價統計結果的標準。

9.2具體的臨床試驗情況

9.2.1臨床試驗所用體外診斷試劑及儀器的名稱、批號、機型等信息。

9.2.2對各研究單位的病例數、年齡分布情況、不同血清型分布情況進行綜合，建議以列表或圖示方式列出各年齡組和各種血清型的樣本例數。

9.2.3質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質控品運行情況。

9.2.4具體試驗過程，樣本收集、樣本保存、樣本檢測、結果處理、結果不一致樣本的確認等。

9.3統計學分析

9.3.1數據預處理、差異數據的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

9.3.2結果的一致性分析

計算陽性符合率、陰性符合率、總體符合率，采用適當的統計學方法，如四格表卡方檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性。

9.4討論和結論

對總體結果進行總結性描述并簡要分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結論。

（八）產品技術要求

申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下，根據申請人產品研制、臨床評價等結果，依據國家標準、行業標準及有關文獻，按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的有關要求，編寫產品技術要求。

腸道病毒核酸檢測試劑的產品性能指標應主要包括：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。陽性參考品主要考察對試劑盒適用范圍內不同血清型腸道病毒的檢測能力，陰性參考品則重點對申報試劑的分析特異性進行驗證。

如果申報試劑已有適用的國家標準品、參考品發布，則申請人應在產品技術要求中提出檢測要求。

按照《辦法》的規定，此類產品為第三類體外診斷試劑，申請人應按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產工藝及半成品要求，附錄的編制應符合相關編寫規范的要求。

（九）產品注冊檢驗報告

根據《辦法》的要求，首次申請注冊的第三類體外診斷試劑產品應在具有相應醫療器械檢驗資質和承檢范圍的醫療器械檢驗機構進行連續3個生產批次樣品的注冊檢驗。對于已經有國家標準品、參考品的檢測項目，在注冊檢驗時應采用相應的國家標準品、參考品進行注冊檢驗，對于目前尚無國家標準品的、參考品的項目，生產企業應建立自己的參考品體系并提供相應的企業參考品。

（十）產品說明書

說明書承載了產品預期用途、標本采集及處理、檢驗方法、檢驗結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據，因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，進口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書中相關技術內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對腸道病毒核酸檢測試劑說明書的重點內容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預期用途】

1.1試劑盒用于定性檢測人鼻咽拭子、咽拭子、糞便/肛拭子、皰疹液、腦脊液或其他樣本的腸道病毒核酸，適用樣本類型應結合實際的臨床研究完成情況進行確認。

1.2明確腸道病毒核酸試劑的臨床意義，主要用于對腸道病毒感染引起的手足口病等的輔助診斷，以便于臨床醫生結合病人的其他檢查結果進行更加準確的疾病判斷和科學的患者管理，應對腸道病毒感染引起的相應臨床癥狀進行描述。

1.3簡單介紹待測目標的特征，如病毒種系淵源、生物學性狀、宿主特性、致病性、感染后臨床表現、待測靶基因特征等。

1.4待測人群特征介紹：具有腸道病毒感染癥狀的患者、相關的密切接觸者、地域要求或年齡限制（如有）等，待測人群應與申報產品臨床試驗中入組人群一致。

1.5應明確申報產品所能檢測病毒血清型及經過臨床驗證的血清型。

1.6應強調實驗操作人員應接受過基因擴增或分子生物學方法檢測的專業培訓，具備相關的實驗操作資格，實驗室應具備合理的生物安全防備設施及防護程序。

2.【檢驗原理】

詳細說明試劑盒技術原理，及核酸分離/純化方法、原理。說明檢測的靶基因座位、序列長度等；介紹引物及探針設計、不同樣品反應體系（管）組合、對照品（質控品）設置及熒光信號標記等。如添加了相關的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應對其作用機理作適當介紹。

3.【主要組成成分】

詳細說明試劑盒內各組分的名稱、數量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質，應說明其生物學來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，應列出相關試劑的生產企業、產品名稱、貨號以及醫療器械注冊證號/備案號（如有）等詳細信息。當試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分時，應在此注明經驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的如上信息。

4.【儲存條件及有效期】

試劑盒的效期穩定性、開瓶穩定性、復溶穩定性、凍融次數要求等，應與相應的穩定性研究結論一致。

5.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

6.【樣本要求】

明確適用的樣本類型。并詳細描述樣本采集及預處理要求、運輸要求、保存條件及期限等。特別是樣本采集所需設備及保存液，需特別明確供應商、貨號及注冊證號/備案號（如有）。有關描述均應建立在相關性能評價及穩定性研究的基礎上。

樣本的取材及處理方式等若有通用的技術規范或指南，則應遵循，并在此處引用。

7.【檢驗方法】

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1試劑配制方法、注意事項。

7.2核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項。對照品（質控品）參與樣本核酸的平行提取的要求等。

7.3擴增反應前準備：各組分加樣體積、順序、相關注意事項等。

7.4逆轉錄過程的溫度和時間設置、PCR各階段的溫度、時間設置、循環數設置及相關注意事項。

7.5儀器設置：特殊參數，待測基因、內標的熒光通道選擇等。

7.6質量控制：說明對照品（質控品）的檢測要求。

8.【陽性判斷值】

簡要總結陽性判斷值研究方法及結論。

9.【檢驗結果的解釋】

結合對照品（質控品）以及樣本管中靶基因和內標的檢測結果，對所有可能出現的結果組合及相應的解釋進行詳述。檢驗結果的解釋應以陽性判斷值的研究結論為依據。如有適用的臨床診療或篩查指南，則應在此項下引用，相應檢驗結果的解釋應符合相關指南的要求。

10.【檢驗方法的局限性】

應至少包括如下描述：

10.1本試劑檢測結果應結合患者臨床癥狀及其他相關醫學檢查結果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據。

10.2針對腸道病毒通用型檢測試劑，未包含在申報產品檢測型別范圍內的腸道病毒血清型。

10.3不合理的樣本采集、轉運及處理以及不當的實驗操作和實驗環境均有可能導致假陰性或假陽性結果。

10.4針對腸道病毒通用型核酸檢測試劑，應明確申報產品所檢病毒血清型中經過臨床驗證的型別，明確其余型別未經臨床驗證。

10.5申報產品應明確不同病程不同階段樣本的陽性率不一致。

10.6取標本期間，接種減毒活疫苗的患者可能會導致檢測試劑檢測結果呈陽性。

11.【產品性能指標】

詳述以下性能指標：

11.1對相應國家標準品、參考品（如有）檢測的符合情況。

11.2最低檢測限：依據分析性能評估資料，說明產品最低檢限，并簡單介紹最低檢測限的確定方法。

11.3企業內部陽性/陰性參考品符合率，陽性/陰性參考品的組成、來源、濃度梯度設置以及評價標準等信息。

11.4精密度：建議詳細描述針對不同腸道病毒基因型，采用不同來源的樣本（如人工模擬樣本和臨床樣本）在各個濃度水平進行的精密度評價結果，可采用列表形式描述。

11.5分析特異性：建議以列表方式說明驗證的其他腸道病毒血清型、相關病原體等的交叉反應性及其驗證濃度水平。總結潛在干擾物質的評價濃度水平及干擾情況。

11.6簡要描述臨床試驗的基本信息、試驗方法和結論。

12.【注意事項】

應至少包括以下內容：

12.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出生物安全性的警告。

12.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號或現行有效版本）等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。

12.3強調產品性能僅針對聲稱的適用樣本類型及【樣本要求】項下說明的樣本采集和處理方法（包括樣本采集液等）進行了驗證，其他樣本類型或樣本采集、處理方法不能保證產品性能。

三、名詞解釋

1.PCR-熒光探針法

在PCR過程中利用熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產物量的變化，并通過對熒光的采集和分析以達到對原始模板量進行分析的PCR。

四、起草單位

國家食品藥品監督管理總局醫療器械技術審評中心。