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人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型、試劑技術審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導原則是針對人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規強制執行，如有能夠滿足法規要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準的不斷完善和科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、范圍

人乳頭瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）屬于乳頭瘤病毒科，是一種小分子的、無被膜包被的1、環狀雙鏈DNA病毒，基因組長約8000堿基對（bp），分為3個功能區，即早期轉錄區（E區）、晚期轉錄區（L區）和非轉錄區（長控制區，LCR）。HPV通過直接或間接接觸污染物品或性傳播感染人類。該病毒不但具有宿主特異性，而且具有組織特異性，只能感染人的皮膚和粘膜上皮細胞，引起人類皮膚的多種乳頭狀瘤或疣及生殖道上皮增生性損傷。

對于感染生殖道和肛門的HPV，根據各基因型別致病力大小或致癌危險性大小可分為低危型和高危型兩大類。在有性生活史的女性中生殖道HPV感染具有普遍性，據統計70%～80%的女性在其一生中會有至少一次的HPV感染，但大多數感染為自限性，超過90％的感染的女性會出現一種有效的免疫應答，在沒有任何長期的健康干預時在6到24個月之間可以清除感染。而持續性的高危型HPV感染則是導致宮頸上皮內瘤變及宮頸癌的主要原因。全球范圍的研究結果顯示，在99.7%的宮頸癌患者體內檢測到高危型HPV DNA的存在，其中HPV16型、18型、45型和31型感染占80%。低危型HPV一般與尖銳濕疣或低度鱗狀上皮內病變相關，極少引起浸潤癌。關于高危型與低危型的劃分，國際上許多機構都給出了參考建議，依據WHO國際癌癥研究機構（IARC）及其他國際組織的研究成果，本指導原則建議將HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種基因型列為高危型別，26、53、66、73、82等5種基因型列為中等風險型別，本指導原則中所述的檢測試劑及其要求均只針對用于宮頸癌相關預期用途的（上述18種）HPV基因型核酸檢測，如申報的宮頸癌相關HPV核酸檢測產品涉及上述18種型別以外的其他HPV基因型，則申請人需提出明確的理由和依據，且應得到國際有關權威機構的文獻支持。下文中述及“高危型”均泛指此18種HPV基因型。

多年來，國際上通用的宮頸上皮內瘤變及宮頸癌的診斷主要遵循“三階梯式”診斷程序，即宮頸細胞學、陰道鏡及組織病理學檢查。宮頸細胞學檢查是普遍應用的宮頸上皮內瘤變及宮頸癌的篩查方法，可發現早期病變。但宮頸細胞學檢查存在其固有的局限性。高危型HPV檢測用于宮頸細胞學檢查異常患者的分流及宮頸癌篩查，可有效地增加宮頸病變檢出率，提高細胞學檢查敏感性，并降低篩查頻率。

本文所述人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑是指利用包括PCR-熒光探針法或其他分子生物學方法在內的核酸檢測技術，以特定高危型HPV核酸（包括DNA和RNA）序列為檢測目的，對人宮頸樣本(如人宮頸脫落上皮細胞或分泌物等)進行體外定性檢測的試劑，以確定受試樣本中是否存在高于陽性判斷值水平的高危型HPV病毒，或同時鑒定感染HPV的基因型別。此類試劑在臨床上用于：1）篩查宮頸細胞學檢查為ASC-US（意義未確定的非典型鱗狀上皮細胞）結果的患者，以確定是否需要進行陰道鏡檢查（以下簡稱ASC-US人群分流用途）；2）對于30歲及以上的女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，與宮頸細胞學檢查聯合進行宮頸癌篩查，此檢測結合細胞學病史和其他風險因素的評估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導患者的管理(以下簡稱宮頸癌聯合篩查用途)；3）對于某年齡段（根據臨床試驗結果而定）女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，進行宮頸癌篩查，此檢測結合細胞學病史和其他風險因素的評估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導患者的管理（以下簡稱宮頸癌初篩用途）。除此以外，若申請人提出其他的預期用途，則應詳細描述相關的臨床背景信息和該檢測與臨床用途的相關性，并在臨床試驗中充分驗證相關的臨床意義。本指導原則僅針對上述三種預期用途提出相關要求。

這里所述的HPV核酸檢測試劑是指可同時檢測多種基因型HPV但不能對陽性結果進行基因分型的試劑，HPV基因分型試劑是指檢測多種基因型HPV的同時可以對HPV陽性結果進行基因分型的試劑。

關于本指導原則所述產品的預期用途還有以下幾點需要強調。第一，在年齡＜30歲的女性中，雖然HPV感染率很高，但其自主清除率也很高，因此對于細胞學檢查正常的受試者不建議再采用HPV檢測做聯合篩查，在經過臨床試驗證實的基礎上亦可直接采用HPV檢測作為初篩方法；此類HPV核酸檢測試劑對不同年齡段人群的適用情況應符合相關宮頸癌篩查指南的要求。第二，HPV核酸檢測試劑用于ASC-US人群分流或宮頸癌篩查時，其可覆蓋的HPV基因型別應至少包含16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型（共13種），亦可同時包含26、53、66、73、82型中的一個或數個型別；根據現有的研究成果，若可檢測的HPV基因型別不能涵蓋上述13種高危型，則可能造成陰性預期值無法達到臨床要求，因此不建議單獨用于上述預期用途。對于基因分型試劑，目前的研究數據已證實16、18型的基因分型檢測用于輔助（宮頸癌篩查中）HPV核酸檢測陽性結果的分析，是有臨床意義的，可以進行注冊申請，申請人應合理陳述預期用途，其性能評估和臨床試驗中適用于本指導原則的部分應參照執行；但應注意：并非所有HPV基因型的分型檢測均有確定的臨床意義，申請人在研發HPV基因分型檢測試劑時應以臨床研究結果為基礎，而不應盲目擴大分型范圍。第三，低危型HPV一般與尖銳濕疣或低度鱗狀上皮內病變相關，但其檢測的臨床價值尚不明確，若申請人提出相關產品注冊，則應詳細解釋其臨床意義和適應癥，并提供充分的證據。第四，鑒于此類試劑的樣本采集方法不利于量值溯源，無法保證定量檢測結果的準確性，因此建議檢測試劑定位為定性檢測，本指導原則不適用于進行定量或半定量HPV核酸檢測試劑的注冊；最后，本指導原則只針對與宮頸上皮內瘤變及宮頸癌相關的高危型HPV檢測，不適用于除宮頸樣本外其他樣本類型的檢測。

本指導原則適用的檢測方法主要指基于核酸檢測的分子生物學技術。現有HPV核酸檢測技術主要包括雜交捕獲法、酶切信號放大法、PCR-熒光探針法、轉錄介導的核酸擴增技術以及PCR-雜交法等。這些方法在性能評價上可能會略有差異，但在技術指標方面均適用于本指導原則，以下有關注冊申報資料的要求主要針對PCR-熒光探針法提出，其他方法學試劑應針對產品自身特點進行相應補充或修正。

由于宮頸癌篩查涉及面廣，故由假陰性和假陽性HPV檢測結果引起的潛在公共衛生損害風險較為顯著。假陰性結果可能導致宮頸癌診斷和治療不及時，假陽性結果可能導致不必要的頻繁篩查和侵襲性處置。因此，確立良好的性能指標并充分理解HPV檢測的臨床意義，對于此類產品的安全有效性評價至關重要。產品性能如不符合臨床需求，可能導致對患者所作的決策錯誤。總體來說，此類試劑分析及臨床性能的評價應有嚴格的控制，同時亦應重點關注臨床的合理應用和檢測結果的科學解釋。

本指導原則僅包括對人乳頭瘤病毒（HPV）核酸檢測及基因分型試劑注冊申報資料中部分項目的要求，適用于進行產品注冊和相關許可事項變更的產品。其他未盡事宜（包括產品風險分析資料等），應當符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（總局令第5號）（以下簡稱《辦法》）等相關法規和文件的要求。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

此類產品的綜述資料中，與預期用途相關的臨床適應征背景情況的描述應著重于高危型HPV核酸檢測和宮頸癌之間的相關性，及HPV檢測臨床應用的限定要求，陳述應科學、客觀且有依據。與國內外同類產品的比較內容應著重從方法學及HPV基因型檢出能力等方面進行比較。綜述資料的撰寫應符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊申報資料要求及說明》（總局公告2014年第44號）（以下簡稱44號公告）的相關要求。

（二）主要原材料研究資料

此類產品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）及企業參考品、試劑盒對照品（質控品）等。應提供主要原材料的選擇與來源、制備及質量標準等的研究資料、對照品（質控品）的定值試驗資料等。

1.引物和探針：應詳述引物和探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。建議設計兩套或多套引物、探針以供篩選，針對所有預期適用的HPV基因型別進行檢出能力和特異性（如交叉反應）的評價，選擇最佳組合，并提交篩選的研究數據。引物、探針的質量標準應至少包括純度檢查、濃度檢查及功能性實驗等。

2.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶，其質量標準應包括DNA聚合酶活性、核酸內切酶活性、熱啟動能力、熱穩定性等；還可能涉及尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）和逆轉錄酶，亦應分別對其酶活性等進行評價和驗證。

3. dNTP：質量標準應至少包括純度檢查及功能性實驗等。

4.若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定，并提交生產工藝驗證報告；如主要原材料購自其他供應商，則需針對供應商的選擇提供評價數據，并提供供應商出具的質量標準、出廠檢定報告，以及申請人對該原材料進行的質量檢驗資料。

5.企業參考品：應詳細說明有關企業參考品的原料選擇、制備、定值過程等試驗資料。

企業參考品的核酸性質（DNA或RNA）應與產品預期檢測的靶物質一致。鑒于HPV病毒尚不能體外培養，企業參考品可采用感染HPV的細胞系，也可采用人工克隆或合成的HPV基因組DNA（或轉錄RNA）等。具體要求如下：

5.1陽性參考品和陰性參考品

無論試劑盒能否進行HPV基因分型，陽性參考品均應針對所有適用的HPV基因型分別設置。陰性參考品應考慮檢測特異性的評價，適當納入其他HPV基因型樣品和其他病原體樣品。

5.2 檢測限參考品

可選擇檢測限濃度或略高于檢測限濃度，并針對不同基因型分別設置。

5.3 精密度參考品

可不包含所有涉及的HPV基因型，但應選擇臨床較常見的或風險程度較高的基因型（至少包含16或18型），并至少設置一個弱陽性水平。

6.試劑盒對照品（質控品）

試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒對照品（質控品）來實現。陽性對照品（質控品）的核酸性質應與待測樣本的靶核酸性質一致，如同為DNA或RNA，其中可不包含所有涉及的HPV基因型，但應選擇臨床較常見的或風險程度較高的基因型，并至少包含16或18型。陰性對照品（質控品）應參與樣本處理和檢測的全過程，如核酸的平行提取等步驟。企業應對陽性對照品（質控品）的檢測結果（如Ct值）做出明確的范圍要求。

內對照（內標）可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，申請人應對內對照（內標）的引物、探針設計和模板濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。對內對照的檢測結果（如Ct值）亦應做出明確的范圍要求。

（三）主要生產工藝及反應體系的研究資料

1.介紹產品主要生產工藝，可以圖表方式表示，并說明主要生產工藝的確定依據。

2.反應原理介紹。

3.詳述樣本收集液、樣本處理方式的選擇和設置，提供相關的研究資料。

4.確定最佳反應體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應各階段溫度、時間、循環數等。

5.不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

6.如申報產品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行工藝優化的研究資料。

（四）分析性能評估資料

申請人應提交生產者在產品研制階段對試劑盒進行的所有性能評價的研究資料，對于每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、試驗方法、可接受標準、試驗數據、統計方法等詳細資料。有關分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點、適用儀器、試劑規格、批號、臨床樣本來源等。

針對不同的樣本采集方式，可能有不同的樣本收集液，申請人應對不同的樣本收集液情況分別完成性能評估，包括最低檢測限和精密度評價等，證明不同的樣本采集方式不會影響試劑的分析性能。

分析性能評價的試驗方法可以參考相關的美國臨床實驗室標準化協會批準指南（CLSI-EP）文件或國內有關體外診斷試劑性能評估的指導原則進行。對于此類產品，性能評估中所用樣品（除非特別說明）可參考上述企業參考品的制備要求。各項性能評價應符合以下要求。

1.核酸分離/純化性能（如適用）

在進行靶核酸檢測前，應有適當的核酸分離/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸分離/純化的組分，企業都應結合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸分離/純化試劑的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，提供詳細的驗證資料。

2.陽性/陰性參考品符合率

陽性參考品的檢測旨在驗證各種HPV基因型均可以在適當的濃度被檢測到。陰性參考品則應檢測為陰性。

3.最低檢測限

針對每種不同的HPV基因型分別配制系列稀釋的樣品進行最低檢測限的評價，系列稀釋度應能夠覆蓋大部分檢出概率區間（0～100%），可通過概率計算或其他適當方法進行測算選取適當檢出率水平的濃度作為最低檢測限確定的標準，如95%（n≥20）或100%的陽性檢出率水平。

4.分析特異性

4.1交叉反應

申請人應針對可在人類泌尿、生殖道寄生微生物或經性傳播的病原體等進行交叉反應驗證，用于交叉反應驗證的樣品，除HPV外，其他病原體應盡量采用滅活病原體培養物或臨床樣本。建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證，通常，細菌感染的水平為106 CFU/mL或更高，病毒為105 PFU/mL或更高。申請人應詳細說明交叉反應樣本來源、病原體鑒定和滴度確定的方法和結果。病原體種類主要考慮以下幾方面：預期用途不包含的其他基因型HPV、人類泌尿、生殖道寄生微生物或可經性傳播的其他病原體、其他常見病原體。（詳見表1）

此外，申請人應針對被檢測靶序列與人基因組及可能存在于人類泌尿、生殖道的微生物基因組進行基因序列比對，并提交比對結果，如有同源性序列則應進行交叉反應驗證。

表1　用于交叉反應研究的病原體

（其中標記*的項目為必做項目）

4.2干擾試驗

應根據所采集樣本類型，針對可能存在的干擾情況進行驗證。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進行評價，并針對有代表性的HPV基因型（如16、18型），至少在HPV臨界陽性水平進行干擾試驗驗證。干擾物質的選取應至少包括：血紅蛋白、白細胞、宮頸粘液、陰道避孕藥物、女性衛生用品、陰道用抗真菌藥物、陰道潤滑劑等。

5.精密度

企業應對精密度指標，如標準差或變異系數等的評價標準做出合理要求。鑒于HPV病毒尚不能體外培養，因此可以采用感染HPV的細胞系，也可采用人工克隆或合成的HPV基因組DNA（或轉錄RNA）等代替；但模擬樣本并不能體現臨床樣本可能帶來的所有變異因素，因此精密度評價中應同時包含若干臨床樣本，且精密度評價試驗應包含核酸分離/純化步驟。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求。

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應對分析儀、操作者、地點、檢測輪次等要素進行相關的驗證。

（2）設定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。

（3）用于精密度評價的人工模擬樣品和臨床樣本均應至少包含3個水平：陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強）陽性樣品，并根據產品特性設定適當的精密度要求，其中，人工模擬樣品應針對所有適用的HPV基因型別分別設置，臨床樣本精密度評價中的每一次檢測均應從核酸提取開始。

（五）陽性判斷值確定資料

對于此類試劑，陽性判斷值即為能夠獲得理想的臨床靈敏度和臨床特異性的臨界值（Cutoff），對于熒光探針PCR方法即為Ct值的確定資料，對于PCR-點雜交法即為最低檢測限（LoD）。建議采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進行相關研究。申請人可選取適當的臨床樣本進行初步試驗以確定陽性判斷值，并在后續臨床試驗中確認其適用性，亦可將此研究納入下文所述的有關ASC-US人群分流的臨床試驗中；無論采用何種方式均應明確樣本入組標準，并說明試驗方案及其合理性。

（六）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的實時穩定性研究，以及試劑開瓶穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性及凍融次數限制等研究。后者則是指適用樣本的保存條件、保存時間等方面的研究，如樣本采集方法不同，則需分別完成穩定性研究。對于此類試劑，如核酸提取液不一定立即進行檢測，則還需對核酸提取液的保存條件和穩定性進行研究。

在穩定性研究中，應選擇適當的溫度范圍，在多個時間點進行評價，申請人應提交有關穩定性研究方案的確定依據、具體的試驗方法及詳細的研究數據、結論。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）臨床試驗

臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應符合相關法規及《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第16號）的要求。

1.試驗方法

此類產品的臨床試驗應包括兩部分內容，第一部分為HPV核酸檢測準確性驗證；第二部分則為試劑盒針對具體預期用途的臨床有效性驗證。兩部分臨床試驗的具體方法應滿足如下要求：

1.1 HPV核酸檢測準確性驗證

申請人應選擇已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品和/或核酸序列測定方法作為對比方法，采用擬申報產品與之進行比較研究試驗，以評價擬申報產品檢測目標HPV基因型的能力。需要注意的是，當擬申報產品的陽性判斷值高于最低檢測限水平時，檢測結果判定為“陰性”的情況包括兩種，其一為待測樣本中存在高于最低檢測限水平的HPV靶核酸，但靶核酸水平低于陽性判斷值；其二為待測樣本中無HPV靶核酸，或靶核酸水平低于最低檢測限水平。在檢測結果的統計分析中應分別列明各種情況，可參考表2。

表2 HPV核酸檢測結果

病例選擇及樣本類型：受試者應包含各種臨床表現的人群，如：宮頸細胞學檢查正常者、宮頸上皮細胞異常者以及診斷為宮頸上皮內瘤變（CIN）和宮頸浸潤癌等的患者，受試者年齡應在<30、30～39、40歲以上年齡段均有分布。樣本類型為人宮頸樣本，總例數不少于500例。對于基因分型試劑的臨床試驗，每種HPV基因型均應具有一定的陽性例數。

鑒于此類產品的樣本采集方法不易標準化，而樣本采集過程對檢測結果的準確性至關重要，因此，如產品可采用不止一種樣本采集方法（包括使用的采集設備和樣本收集液），則應針對不同的采集方式進行同源樣本的比較研究試驗，證明不同的樣本采集方式不會影響檢測結果。相關比較研究試驗應于2家以上（含兩家）臨床試驗機構進行，樣本例數不少于100例。

對比試劑：應選取已上市同類產品和/或核酸序列測定方法。鑒于不同的產品其預期用途涵蓋的基因型別不盡相同，因此應充分考慮對比方法的適用范圍和檢測性能等，確保其與擬申報產品具有可比性。必要時，可同時選取超過一種對比方法，但應以一種方法為主。

統計學分析：應選擇合適的統計學方法對比較研究試驗的檢測數據進行合理分析。對于此類試劑的比較研究試驗，常選擇交叉四格表的形式總結兩種方法定性檢測結果，計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率，并計算95%置信區間，對定性檢測結果進行配對四格表χ2檢驗或kappa檢驗，以考察兩種方法檢測結果的一致性。

對于基因分型試劑，臨床試驗中應分別驗證該產品對可鑒別HPV基因型的臨床檢測準確性，針對不同基因型HPV分別完成如上所述的統計學分析。

結果差異樣本的分析和驗證：對于兩種方法的檢測結果不一致的樣本，申請人應針對具體情況進行合理分析，必要時選擇其他合理的方法進行驗證，亦可結合患者的臨床病情進行分析。

有關核酸序列測定方法的資料要求：臨床試驗中如涉及核酸序列測定方法，則建議對擴增子進行雙向測序。應在臨床研究報告中對選用的測序方法做詳細介紹，并提供以下關于測序試驗的詳細信息及資料。

1)測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。

2)測序方法所用引物相關信息，如基因區段選擇，分子量、純度、功能性試驗等資料。

3)對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與擬申報產品的相關性能進行適當比對分析。

4)測序方法應建立合理的陽性質控品和陰性質控品對臨床樣本的檢測結果進行質量控制。

5)提交有代表性的樣本測序圖譜及結果分析資料。

1.2針對預期用途的臨床有效性驗證

1.2.1針對ASC-US人群分流用途，申請人應在適合進行宮頸細胞學檢查的女性中，入組宮頸細胞學檢查為ASC-US的受試者，應避免選取已確定需進行陰道鏡檢查的人群，以免造成入組人群的傾向性。入組人群應盡量在不同的年齡范圍均有分布（<30、30～39和40以上），各年齡組受試者例數至少應具有統計學意義。針對入組的ASC-US人群首先采用擬申報產品進行HPV核酸檢測，然后，無論HPV檢測結果如何，均應進行陰道鏡檢查，根據陰道鏡檢查結果，必要時取樣進行組織病理學檢查。建議采用同一份宮頸上皮細胞樣本進行細胞學檢查和HPV檢測，以避免樣本取材不同帶來的偏差；而宮頸細胞樣本采集與陰道鏡檢查之間的時間間隔不應過長，建議不超過12周。以陰道鏡檢查和組織病理學檢查結果為金標準，評價擬申報產品的臨床靈敏度、臨床特異性、陽性預期值、陰性預期值、陽性似然比、陰性似然比，并采用適當的方法計算95%置信區間；對于基因分型試劑，還需針對可鑒別的基因型單獨完成上述數據統計分析，應能夠支持基因分型的臨床意義；數據統計和分析方法參見表3和表4。

臨床試驗結果：應通過分析陽性似然比和陰性似然比的結果判斷擬申報產品用于ASC-US人群分流的臨床性能是否能夠滿足臨床要求。

樣本例數：應根據檢測試劑靈敏度要求、疾病發病率等對入組樣本例數進行科學的分析和計算，臨床試驗終點病理學檢查結果≥CIN2的例數應不少于60例。

表3 在ASC-US人群中HPV核酸檢測結果與疾病狀態相關性

針對≥CIN2水平的臨床性能評價：

臨床靈敏度= (A4+A5)/(A4+B4+A5+B5)

臨床特異性= (B1+B2+B3)/(A1+B1+A2+B2+A3+B3)

陽性預期值（PPV）=(A4+A5)/(A1+A2+A3+A4+A5)

陰性預期值（NPV）=(B1+B2+B3)/(B1+B2+B3+B4+B5)

陽性似然比=臨床靈敏度/（1-臨床特異性）

陰性似然比=（1-臨床靈敏度）/臨床特異性

針對≥CIN3水平的臨床性能評價：

臨床靈敏度= A5/(A5+B5);

臨床特異性= (B1+B2+B3+B4)/(A1+B1+A2+B2+A3+B3+A4+B4)

陽性預期值（PPV）=A5/(A1+A2+A3+A4+A5)

陰性預期值（NPV）=(B1+B2+B3+B4)/(B1+B2+B3+B4+B5)

陽性似然比=臨床靈敏度/（1-臨床特異性）

陰性似然比=（1-臨床靈敏度）/臨床特異性

表4在ASC-US人群中HPV基因分型檢測結果

與疾病狀態相關性

    1.2.2針對宮頸癌聯合篩查用途，入組的受試人群應為無宮頸上皮內病變（NILM）的30歲以上女性。

基礎檢測：入組人群應分別接受擬申報產品的HPV檢測，記為基礎檢測數據，其中，若擬申報產品可進行16、18型HPV分型檢測，則16、18型陽性的受試者應立即進行陰道鏡檢查，必要時結合組織病理學檢查，結果為≥CIN2的受試者判為“陽性”，不再進行下述隨訪，其他受試者進入隨訪程序。

受試者隨訪：隨訪時間建議至少持續三年。基礎檢測結果HPV陽性的受試者每年接受隨訪，HPV陰性的受試者每三年接受一次隨訪，以及在隨訪終點接受隨訪。隨訪中應對受試者進行宮頸細胞學檢查，其中檢查結果為正常者繼續隨訪，結果為≥ASC-US的受試者則應進行陰道鏡檢查，必要時結合組織病理學檢查，結果為≥CIN2的受試者判為“陽性”，并終止隨訪，其他均應持續至隨訪終點，最終未發展為≥CIN2的受試者判為“陰性”。

統計學分析：針對HPV基礎檢測結果為陰性和陽性的受試者分別評價其發展為≥CIN2的絕對風險值和發展為≥CIN3的絕對風險值，計算HPV陽性組相對于陰性組發展為≥CIN2和≥CIN3的相對風險值及95%置信區間，應與“1”具有顯著性差異。對于HPV基因分型檢測試劑，還應分別評估可鑒別基因型陽性結果如HPV16+、HPV18+、HPV16和/或18+等相對于HPV陰性和相對于其他HPV基因型別陽性的相對風險，以及其他HPV基因型別陽性及HPV陽性相對于HPV陰性的相對風險。計算相對風險值的95%置信區間，應與“1”具有顯著性差異。此外，HPV陰性人群的絕對風險值應足夠低，以證明該方法對陰性人群的保護作用。最后，應給出受試人群總體的≥CIN2絕對風險值和≥CIN3絕對風險值。風險值的計算可參考如下方法（表5和表6）：

表5 HPV檢測結果和疾病（≥CIN2）狀態相關性

表6 ≥CIN2的風險值計算

95%置信區間的計算方法推薦：Altman等人提出的Score Method或Clopper等人提出的Clopper-Pearson Method。

樣本要求：此項臨床試驗的入組人群應盡量在不同的年齡范圍均有分布（30～39和40以上）。應根據檢測試劑靈敏度要求、疾病發病率等對入組樣本例數進行科學的分析和計算，并根據臨床實際情況對病例脫落比例設定合理要求，隨訪終點病理學檢查結果≥CIN2的例數應不少于60例。

1.2.3針對宮頸癌初篩用途，申請人應按照此項預期用途所述，隨機選取需接受常規宮頸癌篩查且宮頸細胞學檢查結果未知的女性作為受試者。

基礎檢查：所有受試者分別進行HPV檢測和細胞學檢查，作為基礎檢查數據；其中，（HPV基因分型試劑）檢測結果為16/18型（或其他可鑒別基因型）陽性的受試者、HPV陽性同時細胞學檢查結果≥ASC-US的受試者應立即進行陰道鏡檢查，必要時結合組織病理學檢查，結果為≥CIN2的受試者判為“陽性”，不再進行下述隨訪，其他受試者進入隨訪程序。

受試者隨訪：隨訪時間至少持續三年。基礎檢查結果HPV陽性或細胞學檢查≥ASC-US的受試者每年接受隨訪，HPV陰性且細胞學檢查為正常的受試者每三年接受一次隨訪，以及在隨訪終點接受隨訪。隨訪方法與上述第1.2.2條所述一致，至至少三年或組織病理學檢查結果為≥CIN2。

統計學分析：可參照上述第1.2.2條所述方法，HPV+組相對于HPV-組應呈現具有顯著性差異的高風險值,NILM組相對于HPV-組應呈現具有顯著差性異的高風險值。對于HPV基因分型檢測試劑，還應分別評估可鑒別基因型陽性結果如HPV16+、HPV18+、HPV16和/或18+等相對于HPV陰性和相對于其他HPV基因型別陽性的風險，以及其他HPV基因型別陽性及HPV陽性相對于HPV陰性的風險。此外，HPV陰性人群的絕對風險值應足夠低；同時計算受試人群總體的≥CIN2絕對風險值和≥CIN3絕對風險值。

此項臨床試驗的入組人群同樣應在適用的年齡范圍內的不同年齡段均有分布（<30、30～39和40以上），且各年齡段人群均具有一定數量，特別是當該預期用途適用于30歲以下人群時，該年齡段應有一定的陽性樣本量，并針對該年齡段單獨進行數據統計分析，以驗證該試劑的初篩性能。樣本例數、脫落比例的要求可參考上述第1.2.2條。

綜上，申請人應分別從HPV核酸檢測準確性和臨床意義兩方面評價產品的臨床性能。若臨床試驗未得到有顯著統計學意義的結果，申請人應考慮陽性判斷值設置是否科學，受試者入組標準是否存在偏差，受試者例數是否足夠，病例脫落比例是否可以接受，或者隨訪年限是否需要延長等因素。同時，值得注意的是，臨床試驗的結果需綜合評價，除了有關靈敏度、特異性、預期值、似然比、風險值的評價以外，HPV陽性率及CIN發病率等的統計同樣重要，應符合客觀規律。

2.臨床試驗機構的選擇

應選擇不少于3家（含3家）臨床試驗機構，按照相關法規、指導原則的要求開展臨床試驗。臨床試驗機構應獲得國家食品藥品監督管理總局資質認可，其選擇應盡量考慮擬申報產品的特點和預期用途，綜合流行病學背景，使臨床試驗機構和受試者的選擇具有一定的地域代表性。且臨床試驗機構應具有分子生物學方法檢測的優勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節，熟悉評價方案。

3.倫理學要求

臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學準則,必須獲得臨床試驗機構倫理委員會的同意。研究者應考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結果對受試者的風險性，應提交倫理委員會的審查意見及受試者的知情同意書。

4.臨床試驗方案

開展臨床試驗前，申請人應與各臨床試驗機構協商制定統一的、科學合理的臨床試驗方案，并按照臨床試驗方案組織制定標準操作規程，并進行驗證，以確保臨床試驗操作在各個臨床試驗機構之間的一致性。在整個臨床試驗過程中均應遵循預定的方案，不可隨意改動。臨床試驗應在臨床試驗機構的實驗室內進行，并由本實驗室的技術人員操作，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉試驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床試驗都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性，并在臨床試驗方案中詳細說明樣本編盲和揭盲的操作流程。

關于比較研究試驗，各臨床試驗機構選用的對比方法和結果不符樣本的確認方法應一致，以便進行合理的統計學分析；臨床試驗中涉及宮頸細胞學檢查、陰道鏡檢查及組織病理學檢查，應采用統一判讀標準等手段，保持各臨床研究機構間判讀的一致性；受試者隨訪中樣本脫落的判定標準以及試驗數據分析和統計方法等亦應在各臨床研究機構間保持一致。以上內容均應在臨床試驗方案中有明確、清晰的表述。

5.質量控制

臨床試驗開始前，應進行臨床試驗的預試驗，以熟悉并掌握相關試驗方法的操作、儀器、技術性能等，最大限度控制試驗誤差。整個試驗過程都應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

6.臨床試驗總結報告撰寫

根據《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述。

6.1臨床試驗總體設計及方案描述

6.1.1 臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

6.1.2 病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數及標準、樣本編盲和揭盲的操作流程等。

6.1.3 樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

6.1.4 統計學方法、統計軟件、評價統計結果的標準。

6.2 具體的臨床試驗情況

6.2.1 臨床試驗所用體外診斷試劑及儀器的名稱、批號、機型等信息。

6.2.2 對各研究單位的病例數、年齡分布情況、不同基因型分布情況進行綜合，建議以列表或圖示方式列出各年齡組和各種基因型別的樣本例數。

6.2.3 質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質控品運行情況。

6.2.4 具體試驗過程，樣本檢測、樣本長期保存、受試者宮頸細胞學檢查、陰道鏡檢查和組織病理學檢查、數據收集、結果不一致樣本的校驗等；受試者隨訪的操作方法及病例脫落情況，及是否符合臨床試驗方案。

6.3統計學分析

數據處理、差異數據的重新檢測或其他合理方法驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、隨訪中病例脫落比例、研究過程中是否涉及對方案的修改。數據統計分析結果。

6.4 討論和結論

對總體結果進行總結性描述并簡要分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結論。

（八）產品技術要求

申請人應當在原材料質量和生產工藝穩定的前提下，根據申請人產品研制、前期臨床評價等結果，依據國家標準、行業標準及有關文獻，按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第9號）的有關要求，編寫產品技術要求。

HPV核酸檢測及基因分型試劑的產品性能指標應主要包括：物理性狀、試劑盒內陰/陽性對照品（質控品）的符合性、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。陽性參考品主要考察對試劑盒適用范圍內不同基因型HPV的檢測能力，陰性參考品則重點對申報試劑的分析特異性進行驗證。

如果申報試劑已有適用的國家標準品、參考品發布，則申請人應在產品技術要求中提出檢測要求。

按照《辦法》的規定，此類產品為第三類體外診斷試劑，申請人應按照《醫療器械產品技術要求編寫指導原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產工藝及半成品要求，附錄的編制應符合相關編寫規范的要求。

（九）注冊檢驗

根據《辦法》的要求，首次申請注冊的第三類產品應在具有相應醫療器械檢驗資質和承檢范圍的醫療器械檢驗機構進行連續3個生產批次樣品的注冊檢驗。對于已經有國家標準品、參考品的檢測項目，在注冊檢驗時應采用相應的國家標準品、參考品進行注冊檢驗,對于目前尚無國家標準品的、參考品的項目，生產企業應建立自己的參考品體系并提供相應的企業參考品。

（十）產品說明書

說明書承載了產品預期用途、標本采集及處理、檢驗方法、檢驗結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據，因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監督管理總局通告2014年第17號）的要求，進口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書中相關技術內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對HPV核酸檢測及基因分型試劑說明書的重點內容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預期用途】

HPV核酸檢測及基因分型試劑的臨床意義主要在于對婦女罹患宮頸疾病的風險程度提供信息，以便于臨床醫生結合病人的其他檢查結果進行更加準確的疾病判斷和科學的患者管理。

申請人應根據相關臨床研究結果確定產品的預期用途。一般的，此類產品預期用途描述包含以下幾方面：

（1）該產品用于體外定性檢測女性宮頸樣本（如宮頸脫落上皮細胞或分泌物等）中高危型人乳頭瘤病毒（HPV）（列出具體能夠檢測的基因型）核酸（明確檢測靶物質，如DNA、RNA）。明確該產品是否能夠鑒別HPV基因型。

（2）該類產品主要用于：

①篩查宮頸細胞學檢查為ASC-US（意義未確定的非典型鱗狀上皮細胞）結果的患者，以確定是否需要進行陰道鏡檢查（以下簡稱ASC-US人群分流用途）； 

②對于30歲及以上的女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，與宮頸細胞學檢查聯合進行宮頸癌篩查，此檢測結合細胞學病史和其他風險因素的評估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導患者的管理； 

③對于某年齡段（根據臨床試驗結果而定）女性，通過檢測是否有高危型HPV感染，進行宮頸癌篩查，此檢測結合細胞學病史和其他風險因素的評估、以及臨床診療和篩查指南的要求，用于指導患者的管理。

未做相關臨床試驗的產品應在此項下聲明：由于未做相關驗證，本產品不能用于相關臨床預期用途（按照如上項目描述）。

（3）申請人應在此項下強調：

①如申報產品不包含上述第（2）③條所述的預期用途，則申請人應聲明：此檢測不能獨立或優先于宮頸細胞學檢查應用，不推薦在任何年齡段的人群中單獨使用本檢測進行宮頸癌篩查；此方法不能代替宮頸細胞學檢查。

②年齡＜30歲的女性中，HPV感染率很高，同時自主清除率也很高，因此對這部分人群，如宮頸細胞學檢查正常則不應再采用HPV檢測進行聯合篩查，建議僅采用宮頸細胞學方法進行篩查，或參照上述第（2）③條所述進行篩查。

③本試劑檢測結果應結合宮頸細胞學檢查及其他相關醫學檢查結果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據。

④HPV核酸檢測試劑的應用應符合相關臨床診療和篩查指南的要求。

（4）此外申請人還應就以下內容進行簡要介紹：

①臨床背景的介紹，包括病原體生物學特征，基因型劃分，感染后的臨床癥狀及該檢測的臨床意義等。著重說明HPV高危型感染與宮頸癌的相關性，描述應客觀、科學、全面。

②說明申報產品選擇HPV基因型的依據和考慮。原則上建議選擇至少包含16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68基因型在內的多基因型聯合檢測的設計方式，以保證該產品用于宮頸癌篩查及風險評估的能力，亦可同時包含26、53、66、73、82型中的一個或數個型別。不建議包含其他低危型HPV。

2.【檢驗原理】

詳細說明試劑盒技術原理，及核酸分離/純化方法、原理。說明檢測的靶基因座位、序列長度等；介紹引物及探針設計、不同樣品反應體系（管）組合、對照品（質控品）設置及熒光信號標記等。如添加了相關的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應對其作用機理作適當介紹。

3.【主要組成成份】

詳細說明試劑盒內各組分的名稱、數量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質，應說明其生物學來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，應列出相關試劑的生產企業、產品名稱、貨號以及醫療器械注冊證號（如有）等詳細信息。當試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分時，應在此注明經驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的如上信息。

4.【儲存條件及有效期】

試劑盒的效期穩定性、開瓶穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性、凍融次數要求等。應與相應的穩定性研究結論一致。

5.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

6.【樣本要求】 

明確適用的樣本類型。并詳細描述樣本采集及預處理要求、運輸要求、保存條件及期限等。特別是樣本采集所需設備及保存液，需特別明確供應商、貨號及注冊證號（如有）。有關描述均應建立在相關性能評價及穩定性研究的基礎上。

樣本的取材及處理方式等若有通用的技術規范或指南，則應遵循，并在此處引用。

7.【檢驗方法】

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1試劑配制方法、注意事項。

7.2核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項。對照品（質控品）參與樣本核酸的平行提取的要求等。

7.3擴增反應前準備：各組分加樣體積、順序、相關注意事項等。

7.4逆轉錄過程（如涉及）的溫度和時間設置、PCR各階段的溫度、時間設置、循環數設置及相關注意事項。

7.5儀器設置：特殊參數，待測基因、內標的熒光通道選擇等。

7.6質量控制：說明對照品（質控品）的檢測要求。

8.【陽性判斷值】

簡要總結陽性判斷值研究方法及結論。

9.【檢驗結果的解釋】

結合對照品（質控品）以及樣本管中靶基因和內標的檢測結果，對所有可能出現的結果組合及相應的解釋進行詳述。檢驗結果的解釋應以臨床試驗結論為依據。如有適用的臨床診療或篩查指南，則應在此項下引用，相應檢驗結果的解釋應符合相關指南的要求。

10.【檢驗方法的局限性】

應至少包括如下描述：

（1）本試劑檢測結果應結合宮頸細胞學檢查及其他相關醫學檢查結果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據。

（2）不合理的樣本采集、轉運及處理、以及不當的實驗操作和實驗環境均有可能導致假陰性或假陽性結果。

11.【產品性能指標】

詳述以下性能指標：

（1）對相應國家標準品、參考品（如有）檢測的符合情況。

（2）最低檢測限：說明針對各種HPV基因型的最低檢出濃度，并簡單介紹最低檢測限的確定方法。

（3）企業內部陽性/陰性參考品符合率，陽性/陰性參考品的組成、來源、濃度梯度設置以及評價標準等信息。

（4）精密度：建議詳細描述針對各種HPV基因型，采用不同來源的樣本（如人工模擬樣本和臨床樣本）在各個濃度水平進行的精密度評價結果，可采用列表形式描述。

（5）分析特異性：建議以列表方式說明驗證的其他HPV基因型、相關病原體等的交叉反應性及其驗證濃度水平。總結潛在干擾物質的評價濃度水平及干擾情況。

（6）簡要描述臨床試驗的基本信息、試驗方法和結論。

12.【注意事項】

應至少包括以下內容：

（1）如該產品含有人源或動物源性物質，應給出生物安全性的警告。

（2）臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號或現行有效版本）等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。

（3）強調產品性能僅針對聲稱的適用樣本類型及【樣本要求】項下說明的樣本采集和處理方法（包括樣本采集液等）進行了驗證，其他樣本類型或樣本采集、處理方法不能保證產品性能。

三、名詞解釋

1.PCR-熒光探針法

在PCR過程中利用熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產物量的變化，并通過對熒光的采集和分析以達到對原始模板量進行分析的PCR。

2.分析特異性（Analytical Specificity）

測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫學相關濃度值水平的分析干擾程度。

注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應物。

3.精密度（Precision）

在規定條件下，相互獨立的測試結果之間的一致程度。精密度的程度是用統計學方法得到的測量不精密度的數字形式表示，如標準差（SD）和變異系數（CV）。

4.檢測限（Detection Limit, Limit of Detection）

樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測量的最低值。

5.閾值循環數(Cycle threshold, Ct)

實時監測擴增過程中，反應管內的熒光信號到達指數擴增時經歷的循環周期數。主要的計算方式是以擴增過程前3到15個循環的熒光值的10倍標準差為閾值，當熒光值超過閾值時的循環數則為閾值循環數（Ct）。

6.內對照（內標）(Internal Control)

在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結果不理想的原因。

7.意義未確定的非典型鱗狀上皮細胞（ASC-US）

指不能肯定其形態特征及病變性質的形態異常的鱗狀上皮細胞。

8.宮頸上皮內瘤變（CIN）

是一組病變的統稱，包括宮頸不典型增生和原位癌，為宮頸浸潤癌的癌前期病變。此類病變仍限于宮頸上皮層內，未穿透基底膜，無間質浸潤。