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乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測試劑

注冊技術審查指導原則

一、前言

本指導原則旨在指導注冊申請人對乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）脫氧核糖核酸(deoxyribose nucleic acid, DNA)定量檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）定量檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。如申請人認為有必要增加本指導原則不包含的研究內容，可自行補充。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

二、適用范圍

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一個嚴重的公共衛生問題，我國屬乙型肝炎感染地方性流行區。根據2006年全國乙型肝炎流行病學調查，我國的慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例，每年因乙型肝炎導致的肝硬化和肝癌死亡約30余萬例，新發乙型肝炎病例約50 萬～100萬例，乙肝防治是當前及今后相當長時間內要面臨的重要任務。

乙型肝炎是血源傳播性疾病，主要經血（如不安全注射等）、母嬰及性接觸傳播。HBV屬嗜肝脫氧核糖核酸（DNA）病毒科（hepadnaviridae），基因組長約3.2 kb，為部分雙鏈環狀DNA。急性HBV感染DNA存在先陽性后消失的發展過程，慢性HBV感染的自然史一般可分為4個期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動或低（非）復制期和再活動期，其中免疫耐受期HBV DNA滴度較高（大于20 000 IU/ml），免疫清除期表現為血清HBV DNA滴度大于2000 IU/ml，但一般低于免疫耐受期。非活動或低（非）復制期滴度較低（小于2000 IU/ml），部分再活動期患者表現為HBV DNA活動性復制，但并不是所有HBV感染者都經歷以上四期。

HBV已發現有9個基因型（A～I），每個基因型又可分為不同亞型，且存在基因型之間的重組現象。我國已發現A、B、C、D基因型，中東部地區以B、C基因型占優勢，其中北方地區（長江以北）主要為C2亞型；南方大部分地區流行株為B2、C2、C1亞型，并有少部分D基因型；西部地區尤其是新疆地區以D基因型為主，西部藏族居民中以C/D重組基因型為主；A型和B1亞型罕見。

HBV DNA定量檢測試劑是指利用包括實時熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）或其他的分子生物學方法在內的核酸檢測技術，以HBV基因序列為檢測靶標，對人血清、血漿及其他人體樣本中的HBV DNA進行體外定量檢測的試劑。結合臨床表現和其他實驗室指標，可作為乙型肝炎輔助診斷的指標之一，還可通過對血液中HBV DNA濃度的檢測可用于HBV感染的輔助診斷、治療適應癥的選擇及抗病毒療效的判斷。

本指導原則適用于實時熒光PCR方法的HBV DNA定量檢測試劑，其他類同用途的核酸定量檢測方法可參照本指導原則，但應根據產品特性確定其中具體內容是否適用，如不適用，應另行選擇符合自身方法學特性的技術要求或評價方法。本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產品。

本指導原則不適用于國家法定血源篩查用HBV DNA檢測試劑。

三、基本要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及同類產品上市情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從方法學及檢出限等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監械〔2007〕229號）和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監械〔2007〕609號）的相關要求。

（二）產品說明書

說明書承載了產品預期用途、試驗原理、試驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據。因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國食藥監械〔2007〕240號）的要求，境外產品的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書的所有內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨列明參考文獻的相關信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國食藥監械〔2007〕240號）的要求，下面對HBV DNA定量檢測試劑說明書的重點內容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地制定產品說明書。

1.【預期用途】應至少包括以下幾部分內容：

（1）試劑盒用于定量檢測人血清、血漿等樣本中的HBV DNA，適用樣本類型應依據申報產品的分析性能評估和臨床研究情況進行確認。

（2）待測人群特征介紹：主要為接受抗病毒治療的乙型肝炎患者。

（3）臨床用途：主要通過對乙型肝炎患者血中HBV DNA基線水平和變化情況的監測，用于評估抗病毒治療的應答和治療效果監測。

  如有其他用途（如隱匿性感染的輔助診斷）則應對產品適應癥人群、預期用途另行說明，并提供與之相應的分析性能評估以及臨床驗證等資料。本指導原則內容僅針對治療監測用途進行要求。

（4）應當說明該試劑檢測結果不得作為患者病情評價的唯一指標，必須結合患者臨床表現和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。

（5）明確說明該檢測試劑不得用于血源篩查。

2.【主要組成成分】

（1）說明試劑盒所包含組分的名稱、數量、比例或濃度等信息，如定量標準品、陰/陽性質控品含有人源組分，應提供其生物學來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

（2） 試劑盒中不包含但該項檢測必需的組分，說明書中應列出相關試劑/耗材的名稱、注冊證號（如有）及其他相關信息。

（3）如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應在此注明經驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產企業、產品名稱、注冊證號（如有）以及配套儀器等詳細信息。

3.【儲存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩定性、開封穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性、凍融次數要求等，應標明具體的儲存條件及效期。

4.【樣本要求】

（1）樣本收集要求：結合臨床需要并參照慢性乙型肝炎防治指南（現行版）推薦的采樣要求。

（2）血液樣本應當說明對采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應說明樣本采集、處理及保存方式。

（3）樣本處理、運送及保存：對血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預處理、運送條件、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復至室溫，凍融次數的要求。如有需要應對高于檢測范圍的樣本稀釋方法進行規定。

5.【適用機型】注明所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

6.【檢驗方法】詳細說明試驗操作的各個步驟，包括：

（1）試劑準備及配制方法、注意事項。

（2）詳述待測樣本、相關校準品及質控品核酸提取的條件、步驟及注意事項。

（3）核酸提取/純化方法的詳細介紹。

（4）擴增反應前準備：加樣體積、順序等。

（5）PCR各階段的溫度、時間設置、循環設置及相關注意事項。

（6）儀器設置：特殊參數、結合探針的熒光素標記情況對待測基因及內標的熒光通道選擇。

（7）基線、循環閾值（Ct值）的選擇方法。

（8）校準方法的描述。

（9）實驗的有效性判斷：試劑盒內陰/陽性質控品、內標的Ct值要求。

7.【檢驗結果的解釋】

檢驗結果應用IU/ml表示，結合陰、陽性質控結果，對低于檢出限未檢出、低于定量限、檢測范圍內及高于檢測范圍的檢測結果分別進行界定。

8．【檢驗方法的局限性】

（1）本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應結合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

（2）不合理的樣本采集、轉運、儲存及處理過程均有可能導致錯誤的檢測結果。

（3）明確該試劑僅限于規定的樣本類型及適用機型。

9.【產品性能指標】詳述以下性能指標：

（1）對相應國家參考品的符合情況。

（2）最低檢出限及定量限：說明試劑不同樣本類型的最低檢出濃度和最低定量濃度，簡單介紹最低檢出限/定量限的確定方法以及對最低檢出限/定量限驗證所采用的基因型。

（3）精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價標準、評價結果。

（4）線性范圍：確定線性范圍的方法、濃度范圍、相關系數等信息。

（5）對不同基因型的覆蓋：驗證該試劑對HBV不同基因型的檢測效果。

（6）特異性：

①臨床特異性：應采用一定數量的臨床HBV DNA陰性樣本進行驗證。

②交叉反應：易產生交叉反應的其他病原體核酸的驗證情況，建議以列表的方式表示經過交叉反應驗證的病原體名稱、型別、濃度等信息。

③干擾物質：樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等，應注明可接受的最高限值。

④藥物影響：常用抗病毒藥物、干擾素等對檢測結果的影響，如未進行相關研究也應提供相關警示說明。

（7）對比試驗研究：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統計學方法及統計分析結果。

10.【注意事項】應至少包括以下內容：

（1）有關人源組分（如有）的警告，如：試劑盒內校準品、質控品或其他可能含有人源物質的組分，雖已通過乙型肝炎表面抗原（HbsAg）、人類免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV1/2）、丙型肝炎抗體（抗-HCV）等項目的檢測為陰性，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應將這些組分作為潛在傳染源對待。

（2）臨床實驗室應嚴格按照《臨床基因擴增實驗室工作規范》配備設備及操作人員，應嚴格按照說明書要求進行操作。

（三）擬定產品標準及編制說明

擬定產品標準應符合國食藥監械〔2007〕229號和國食藥監械〔2007〕609號文件的相關規定。另外，對于國產試劑，應參考《中國生物制品規程》（2000年版），將擬申報產品的主要原材料、生產工藝及半成品檢定等內容作為附錄附于標準正文后，并在正文的“產品分類”項中引出該附錄內容。附錄中應將待測靶基因區域，引物/探針來源及驗證情況，各種酶的來源、特性以驗證情況等信息的重點內容予以明確。

HBV DNA定量檢測試劑的注冊檢測應符合相應國家參考品檢測要求。產品的性能指標應與說明書內容相符。

如果擬申報試劑已有相應的國家/行業標準發布，則企業標準的要求不得低于上述標準要求。

（四）注冊檢測

根據國食藥監械〔2007〕229號要求，首次申請注冊的第三類產品應在國家食品藥品監督管理局認可的、具有相應承檢范圍的醫療器械檢測機構進行連續三個生產批次樣品的注冊檢測。對于已經有國家參考品的HBV DNA項目，在注冊檢測時應采用相應的國家參考品進行。

（五）主要原材料研究資料

應提供主要原材料如引物、探針、酶、標準品或企業參考品等的選擇與來源、制備過程、質量分析和質控標準等的相關研究資料。若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須穩定；如主要原材料源于外購，應提供的資料包括：供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。

1.企業內部參考品的制備、定值過程。建議采用滅活病毒的血清/血漿建立參考品，不宜使用質粒。

2.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

3.聚合酶鏈反應（PCR）組分的主要材料（包括引物、探針、內標、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質量標準及實驗研究資料，主要包括以下內容：

（1） 脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩定性等的詳細驗證資料。

（2）引物

由一定數量的dNTP構成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，并對序列準確性、純度、穩定性、功能性實驗等的驗證。如為外購，應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）結果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

（3） 探針

特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經PAEG或其他適宜方法純化，在5'-端(和/或3'-端)進行標記，如熒光素報告基團或其他發光標記物，在3'-端標記熒光素淬滅基團，并經HPLC或其他適宜方法純化,純度應達到高效液相色譜純。如為外購，應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如HPLC分析圖譜；應對探針的核酸序列及標記的熒光素或化學發光物進行核實，并作HPLC分析。

（4） PCR反應所需酶

DNA聚合酶，應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性，具熱穩定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性，應對酶活性有合理驗證；應提供有關保存穩定性、活性及功能實驗等的驗證資料。

4.內對照（內標）、校準品及質控品的原料選擇、制備、定值過程及試驗資料。內標設置應合理，質控品宜采用混合陰性人血漿或血清作為基質。

5.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無脫氧核糖核酸酶（Dnase）和核糖核酸酶（Rnase）污染。

（六）主要生產工藝及反應體系的研究資料

基本生產工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對pH、電導率等關鍵參數進行有效控制。

生產工藝研究的資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應條件、校準方法、質控方法、穩定性和有效期，提供確切的依據，主要包括以下內容：

1.主要生產工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應原理介紹。

3.基因位點選擇、PCR方法學特性介紹。

4. DNA提取純化方法優化，建議包含純化步驟，內標、校準品、質控品均應全程參與提取純化，不建議采用煮沸法進行DNA提取。

5.確定最佳PCR反應體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度、樣本量、加樣量及反應體積等。樣本量應不少于200微升，加樣量和反應體積參考相應行業標準，經研究驗證后確定。

6.確定PCR各階段溫度、時間及循環數的研究資料。

7.對于基線閾值（threshold）和閾值循環數（Ct）確定的研究資料。

8.不同適用機型的反應條件的對比分析，如果有差異應分別詳述。

另外，對于試劑盒的內標、校準品、質控品設置，建議企業參考以下要求執行：

（1）樣本反應管應設置合理的內對照（內標）以對管內抑制可能造成的假陰性結果進行質控。申請人應對內標的引物、探針和模板的濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線，但又不能對目的基因的檢測造成競爭性抑制而導致假陰性，對內標的Ct應有明確的范圍要求。

（2）HBV DNA定量檢測試劑的質控品應至少設置三個量級水平的系列質控品:臨界陽性質控品、強陽性質控品和陰性質控品。校準品和質控品均應參與樣本核酸的平行提取，以對整個PCR反應過程、試劑/設備、交叉污染等環節進行合理質量控制。企業應對各種質控品的Ct做出明確的范圍要求。

（七）分析性能評估資料

申請人應提交生產者在產品研制或成品驗證階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，對于每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、實驗設計、研究方法、可接受標準、實驗數據、統計方法等詳細資料。有關分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現，包括實驗地點（實驗室）、適用儀器、試劑規格、批號、臨床樣本來源等。分析性能評價的實驗方法可以參考相關的美國臨床實驗室標準化協會批準指南（CLSI-EP）文件或國內有關體外診斷產品性能評估的指導原則進行。對于HBV DNA定量檢測試劑，建議著重對以下分析性能進行研究。

1. HBV DNA提取

病毒DNA提取主要有以下目的：富集目的基因濃度、保證目的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定PCR成敗的關鍵環節。因此，無論申報產品是否含有DNA分離/純化的組分，企業都應對核酸提取的環節做詳細的驗證。臨床標本中可能含有各式各樣的PCR抑制物，因此，對于DNA提取試劑的選擇，除最大量分離出目的DNA外，還應有純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。目前常見的DNA分離純化方法和改良方法各有優勢和不足，申請人應結合申報產品的特性，合理選擇DNA分離/純化試劑，并提供詳細的驗證資料（提取效率、與后續試驗的配合等）。

2.最低檢出限與定量限（分析靈敏度）

（1）最低檢出限與定量限的確定

建議使用國際參考品/國家參考品進行梯度稀釋并多次檢測，將具有95%以上陽性檢出率的病毒水平作為最低檢出限。建議最低檢出限應不高于30IU/ml。

定量限應高于或等于檢出限，將多次（至少10次）測量的結果符合試劑準確度要求的最低病毒水平作為定量限。

（2）最低檢出限和定量限的驗證

申報試劑應在最低檢出限或接近最低檢出限的病毒濃度對不同基因型（至少包括B、C、D型）進行驗證，總測試數不少于60次。定量限的驗證應對不同基因型（至少包括B、C、D型）進行驗證，總測試數不少于40次。

企業應能夠提供用于最低檢出限/定量限驗證的各個病毒株的來源、型別確認及滴度確認試驗等信息。

3.線性范圍

線性范圍確定的研究應使用高值臨床樣本（由可溯源至國家參考品/國際參考品的方法定量）進行梯度稀釋，稀釋液應使用經確認為陰性的混合人血清或血漿，應包含不少于9個濃度（應包含接近最低檢測限的臨界值濃度），使用至少3個批次的試劑進行試驗。通過評價一定范圍內的線性關系及各水平的準確度確定該產品的線性范圍。

4.準確度

對測量準確度的評價依次包括：與國家參考品（和/或國際參考品）的比對研究、回收實驗、方法學比對等方法，企業可根據實際情況選擇合理方法進行研究。

（1）國家/國際參考品驗證

此類檢測試劑有相應的國家/國際參考品，應使用國家/國際參考品對試劑進行驗證，重點觀察對相應參考品檢測結果的符合情況。

（2）回收試驗。用于評估定量檢測方法準確測定加入純分析物的能力，結果用回收率表示。通常對樣本進行3～5次回收試驗，取平均值即平均回收率。

回收試驗注意事項：

①加入的標準液體積一般應小于樣本體積的10%；

②盡量使加入標準液后樣本中的被測物濃度接近醫學決定水平；

③標準物的濃度應該足夠高，以得到不同濃度的回收樣本；

④注意基質效應，盡量采用與臨床待測樣本一致的基質

（3）方法學比對

采用參考方法或國內/國際普遍認為質量較好的同類試劑作為對比方法，與擬申報試劑同時檢測一批病人樣品，從測定結果間的相關性了解擬申報試劑與參比方法間的一致情況。如顯著相關，說明兩檢測系統對病人標本測定結果基本相符，對同一份臨床樣本的醫學解釋，擬申報試劑與對比方法相比不會產生顯著差異結果。
    在實施方法學比對前，應分別對擬申報試劑和對比試劑進行初步評估，只有在確認兩者都分別符合各自相關的質量標準后方可進行比對試驗。方法學比對時應注意質量控制、樣本類型、濃度分布范圍并對結果進行合理的統計學分析。
    5.精密度

測量精密度的評價方法并無統一的標準可依，可根據不同產品特征或企業的研究習慣進行，前提是必須保證研究的科學合理性，具體實驗方法可以參考相關的美國臨床實驗室標準化協會批準指南（CLSI-EP）或國內有關體外診斷產品性能評估的文件進行。企業應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數的范圍等。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求：

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報試劑（包括提取組分和聚合酶鏈反應組分）本身的影響外，還應對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關的驗證。

（2）合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間精密度進行評價。

（3）用于精密度評價的質控品應至少包括四個水平:

①陰性質控品：不含乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）的質控品，不得檢出陽性（n≥20）。

②臨界陽性質控品：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢出限，陽性檢出率應高于95%（n≥20）。

③弱陽性質控品：待測物濃度呈弱陽性（高于定量限濃度1個數量級），陽性檢出率為100%且變異系數（CV）符合標準要求（n≥20）。

④強陽性質控品：待測物濃度呈中度至強陽性，陽性檢出率為100%且CV符合標準要求（n≥20）。

6.HBV不同基因型的覆蓋

應對乙肝病毒不同基因型（至少包括B、C、D型）進行檢測，重點考察各基因型病毒樣本的分析靈敏度、準確性及精密度指標，每個基因型的病毒樣本稀釋成至少3個濃度水平，對每水平樣本進行重復測定。

7.特異性

（1）交叉反應

①用于HBV DNA檢測試劑交叉反應驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀（推薦種類見表1）。

②建議在病毒和細菌感染的醫學相關水平進行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的水平為10⁶ cfu/ml或更高，病毒為10⁵ pfu/ml或更高。

③申請人應提供所有用于交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。有關交叉反應驗證的信息應以列表的方式在產品說明書的【產品性能指標】項中有所體現。

表1  用于交叉反應研究的微生物（推薦）

（2）干擾物質

①潛在的干擾物質主要包括：內源性物質（見表2）和常用的治療藥物如普通IFNα（2a、2b和1b）和聚乙二醇干擾素α（2a和2b）[PegIFNα（2a和2b）]、拉米夫定（lamivudine）、阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）、恩替卡韋（entecavir）、替比夫定（telbivudine）等。

②使用醫學相關水平的干擾物濃度進行驗證，另外，亦建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度(最差條件)條件下進行評價。對于常見藥物干擾試驗，建議參照相應藥物藥代動力學研究確定的治療藥物濃度添加相應藥物進行干擾驗證。

③建議在病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質的干擾影響進行檢測。

表2  建議用于干擾研究的物質（推薦）

*為必須驗證的干擾物質。

8.溯源性

應提交詳細的溯源性研究資料。企業制備的企業內部參考品、二級參考品、用于制備商品化校準品的儲備液以及不同基因型的陽性樣本均應能夠溯源至國家參考品/國際參考品。使用國家參考品/國際參考品為校準品，應用多臺儀器對企業一級參考品進行校準，以下逐級對企業二級參考品、校準儲備液、陽性參考品進行校準。

9.其他需注意問題

對于適用多個機型的產品，應提供如產品說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。如適用于不同樣本類型，應提交對不同樣本類型一致性的驗證，包括不同抗凝劑、采血管的驗證。

（八）參考值（范圍）確定資料

對于此類試劑，正常人群中不應檢出HBV DNA，參考值確定資料主要是指Ct的確認資料，建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產品用于結果判斷的臨界值予以確認。

（九）穩定性研究資料

穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括實時穩定性（有效期）、運輸穩定性、開瓶穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于實時穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應對樣本穩定性進行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩定性。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。

試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（十）臨床試驗研究

1.研究方法

對于該類試劑已有同類產品上市，按照法規要求選擇境內已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為對比試劑，采用擬申報產品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產品等效或優于已上市產品。

建議預實驗選擇兩種對比試劑同時進行驗證，考察其誤差范圍，選擇其中一種作為正式試驗的對比試劑，另一種可作為第三方試劑。對比試劑的適用樣本類型及檢測范圍應能夠涵蓋考核試劑的樣本及檢測性能要求，以免造成考核試劑部分性能無法驗證的情況。

對比試驗結果不一致（檢測值差異較大）的樣本應采用公認較好的第三方試劑進行驗證。

2.臨床研究單位的選擇

建議申請人在選擇臨床研究單位時，應考慮到各試驗單位之間的平行性和一定的地域代表性，臨床研究單位應具有分子生物學方法檢測的優勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節（儀器、試劑、質控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和對比試劑都應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床研究機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各研究單位選用的對比試劑應一致，以便進行合理的統計學分析，同時方案中應明確寫明對于對比試驗研究中測定結果不符的樣本進行確認試驗的第三方試劑或方法。

4.病例選擇及樣本類型

臨床試驗應樣本數需不少于500例，其中應主要選擇乙型肝炎患者樣本（陽性樣本），不少于450例。在病例選擇時應考慮到地域性的差別，應涵蓋不少于10例D基因型，應注重不同藥物治療的乙型肝炎患者。陽性樣本應覆蓋試劑線性范圍，均勻分布高、中、低值。建議選擇不少于50例的陰性樣本進行比對試驗，陰性樣本主要考慮可能存在的交叉反應情況，應選擇其他類肝炎病毒感染、其他良性或惡性肝臟疾病患者，以從臨床角度考察其特異性。

臨床試驗中所涉及的樣本類型應為實際臨床檢測中常用的樣本類型。對于同時能夠檢測血清和血漿樣本的試劑，應對至少50例同一乙型肝炎患者分別采集的血清和血漿樣本進行比對試驗研究，陽性樣本應包括強、中、弱陽性及部分陰性樣本。

臨床研究應以新鮮樣本為主，如采用庫存樣本應另行說明 。

5.統計學分析

對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，對于本類產品對比實驗的等效性研究，常用相關性、線性回歸對log10滴度結果進行統計分析，考察兩組數據之間是否存在相關性，統計分析應可以證明兩種方法的檢測結果無明顯統計學差異。在臨床研究方案中應明確統計檢驗假設，即評價考核試劑與對比試劑是否等效的標準。選擇交叉四格表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表卡方或kappa檢驗，對檢驗結果進行符合率分析，計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率。

6.結果差異樣本的驗證

在數據收集過程中，對于兩種試劑的檢測結果有不一致（檢測結果差異較大）的樣本，應采用臨床上公認較好的第三種同類試劑進行確認試驗，同時結合患者的臨床病情對差異原因及可能結果進行分析。

7.臨床試驗總結報告撰寫

根據《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》（國食藥監械〔2007〕240號）的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述。

（1）臨床試驗總體設計及方案描述

① 臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

② 病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數及標準。

③ 樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

④ 統計學方法、統計軟件、評價統計結果的標準。

（2） 具體的臨床試驗情況

① 申報試劑和對比試劑的名稱、批號、有效期及所用機型等信息。

② 對各研究單位的病例數、年齡分布情況、不同基因型分布情況進行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數及百分比。

③ 質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質控品運行情況，對檢測精密度、質控品測量值的抽查結果評估。

④ 具體試驗過程，樣本檢測、數據收集、樣本長期保存、結果不一致樣本的校驗等。

（3） 統計學分析

① 數據預處理、差異數據的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

② 兩組數據結果的相關性、線性回歸的結果。

③ 對相關性及線性方程的顯著性檢驗，驗證兩種試劑定量結果的一致性。

④陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區間。

⑤以交叉表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表卡方或kappa檢驗。

另外考慮到對不同樣本類型的檢測結果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型分別進行統計分析，以對考核試劑的臨床性能進行綜合分析。

（4） 討論和結論

對總體結果進行總結性描述并簡要分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結論。

四、名詞解釋

精密度（precision）：在規定條件下，相互獨立的測試結果之間的一致程度。精密度的程度是用統計學方法得到的測量不精密度的數字形式表示，如標準差（SD）和變異系數（CV）。

五、參考文獻

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3.《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》，（國食藥監械〔2007〕240號），2007年4月28日。

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