一、乙型肝炎病毒耐藥基因檢測(cè)的臨床意義
WHO相關(guān)資料顯示，全球感染過乙型肝炎病毒（HBV）的患者超過三分之一，而慢性乙型肝炎患者約有2.4億，乙肝嚴(yán)重影響著人類的生命健康。HBV是傳染性疾病乙型病毒性肝炎的主要病因，感染HBV可引起肝硬化甚至肝細(xì)胞癌變。HBV屬嗜肝DNA病毒科，為雙鏈DNA病毒，容易發(fā)生變異，從而形成不同的基因型。目前已根據(jù)HBV核苷酸序列異質(zhì)性≥8%將其分成A-J 10種基因型[1-2]。在我國(guó)北方以C型為主，南方以B型為主，新疆有出現(xiàn)D型。作為常規(guī)抗病毒治療的核苷（酸）類似藥物，拉米夫定(LAM)和阿德福韋酯(ADV)等能夠有效抑制HBV的復(fù)制，然而長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致耐藥的發(fā)生，使治療效果明顯下降。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)用于HBV的基因分析，從而為乙肝患者的抗病毒治療提供科學(xué)的依據(jù)。盡早檢測(cè)HBV變異，準(zhǔn)確判斷拉米夫定和阿德福韋酯等治療后耐藥，指導(dǎo)個(gè)性化用藥，對(duì)于提高乙肝治療成功率具有很重要的價(jià)值。
二、乙型肝炎病毒耐藥機(jī)制以及常見的突變基因位點(diǎn)
HBV基因型耐藥是指乙肝病毒出現(xiàn)某種特定的突變，這些特定的突變點(diǎn)導(dǎo)致HBV耐藥。其分子機(jī)制是：HBV是一種變異較高的病毒，在復(fù)制過程必須經(jīng)過RNA中間體的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制步驟，但RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，因此在宿主免疫壓力和抗病毒藥物的選擇壓力下，其核酸在少數(shù)位點(diǎn)上發(fā)生突變是一種常見現(xiàn)象。
HBV對(duì)核苷（酸）類似物耐藥的產(chǎn)生與HBV聚合酶基因變異有關(guān)，并且HBV聚合酶基因變異是多位點(diǎn)的，以C區(qū)YMDD（酪氨酸－蛋氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸）基序的變異最為重要。拉米夫定(LAM)的主要耐藥位點(diǎn)位于C區(qū)（rtM204V/I），204位點(diǎn)的蛋氨酸被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）置換，即rtM204V/I。上述突變直接導(dǎo)致病毒對(duì)藥物的敏感性降低，被稱為原發(fā)耐藥突變。另外部分突變不直接引起病毒對(duì)藥物敏感性的下降，但可以恢復(fù)原發(fā)耐藥變異病毒受損的復(fù)制力，被稱為補(bǔ)償耐藥突變，主要有rtV173L、rtL180M(常與rtM204V共同出現(xiàn))和rtL80I(常與rtM204I共同出現(xiàn))[3]。比如，HBV雙點(diǎn)突變株如rtM204V/rtL180M，其病毒復(fù)制能力強(qiáng)于rtM204I的單點(diǎn)突變株，可能與rtL180M（B區(qū)）的變異補(bǔ)償C區(qū)YMDD變異株的復(fù)制缺陷有關(guān)。而另一種代表藥物阿德福韋酯(ADV)，其耐藥變異位點(diǎn)則主要集中于HBV聚合酶基因B區(qū)rtA181T和D區(qū)rtN236T位點(diǎn)。
三、乙型肝炎病毒耐藥基因檢測(cè)方法[4-6]
1.PCR產(chǎn)物直接測(cè)序：是將HBV基因組的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增后直接進(jìn)行測(cè)序分析的方法。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法可檢測(cè)已知和可能的未知耐藥變異位點(diǎn)，是最常用的基因型耐藥檢測(cè)方法之一。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法一般作為基因型耐藥檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法的缺點(diǎn)是靈敏性較差，只有當(dāng)變異株超過HBV準(zhǔn)種池的20%時(shí)才能被發(fā)現(xiàn)。
2.聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)：該方法具有較強(qiáng)的靈敏性，可檢測(cè)數(shù)量占HBV準(zhǔn)種池5%的耐藥變異株。但是PCR-RFLP只能檢測(cè)已知、單一位點(diǎn)的變異，對(duì)于少數(shù)耐藥變異位點(diǎn)監(jiān)測(cè)不失為一種簡(jiǎn)便、快速且廉價(jià)的方法。但隨著多種核苷（酸）類似物的相繼問世和HBV耐藥變異位點(diǎn)的不斷出現(xiàn)，該方法將難以勝任多位點(diǎn)變異的檢測(cè)。
3.反向雜交法：基于該技術(shù)的INNO-LiPA方法在國(guó)外已獲準(zhǔn)應(yīng)用于臨床檢測(cè)，目前INNO-LiPA HBV DR v3 可檢測(cè)包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)與阿德福韋酯(ADV)常見耐藥位點(diǎn)。該法可檢測(cè)變異株占HBV準(zhǔn)種池5% ~ 10%的樣品，故敏感性較好，但其同樣只能檢測(cè)已知位點(diǎn)變異。
4.實(shí)時(shí)熒光PCR：該方法操作簡(jiǎn)便，可檢測(cè)變異發(fā)生率低于10%的耐藥變異。僅能檢測(cè)已知位點(diǎn)。
5.基因芯片：亦稱DNA芯片、DNA微陣列，可檢測(cè)已知變異位點(diǎn)。
6.限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性技術(shù)：該技術(shù)是將PCR-RFLP技術(shù)與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，靈敏度高，能夠發(fā)現(xiàn)數(shù)量不足HBV準(zhǔn)種池1%的變異株，但其同樣僅能檢測(cè)已知位點(diǎn)變異，且價(jià)格昂貴，很難在臨床推廣應(yīng)用。
四、目前已上市產(chǎn)品介紹
我國(guó)已批準(zhǔn)上市的乙型肝炎病毒耐藥基因檢測(cè)試劑盒較多采用熒光PCR法，主要為國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品，針對(duì)的基因突變位點(diǎn)主要是204位點(diǎn)的YMDD→YIDD（550ATG→ATT及550ATG→ATC）與YMDD→YVDD（550ATG→GTG）。還有較少產(chǎn)品能夠檢測(cè)發(fā)生在180位點(diǎn)（rtL180M）的基因突變。
五、小結(jié)
由于肝細(xì)胞中的共價(jià)環(huán)狀閉合DNA持續(xù)存在，使得乙肝患者需要長(zhǎng)期用藥治療。抗HBV核苷（酸）類藥物主要有拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、恩替卡韋(ETV)、阿德福韋酯(ADV)和富馬酸替諾福韋酯(TDF)，其中前4種已在我國(guó)上市。長(zhǎng)期使用核苷（酸）類似藥物不可避免地導(dǎo)致耐藥基因突變，最終病毒恢復(fù)復(fù)制能力，病情反彈。盡早進(jìn)行乙肝病毒耐藥基因突變的檢測(cè)，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒的耐藥情況，指導(dǎo)醫(yī)生合理用藥。隨著生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，為此類產(chǎn)品的技術(shù)審評(píng)帶來挑戰(zhàn)。
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